成玲俐,吳素華,李志梁,唐,張 瑞

(1.南海鹽步醫(yī)院,廣東佛山528247;2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院;3.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院)

在動(dòng)物體內(nèi)阻斷左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)造成急性心肌缺血,并在預(yù)定時(shí)間內(nèi)恢復(fù)血供予以再灌注,是模擬人類缺血性心臟病恢復(fù)血供治療必需的實(shí)驗(yàn)方法。由于大鼠在進(jìn)化關(guān)系上比較接近人類,且其冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)少、心肌壞死出現(xiàn)早、心律失常發(fā)生率高、穩(wěn)定性好,且大鼠制作模型費(fèi)用低廉,從而成為制作心肌缺血再灌注損傷模型的首選,結(jié)扎大鼠LAD形成心肌梗死是目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的模型制備方法。但以往模型制備過(guò)程中存在諸多不便,如:手術(shù)時(shí)反復(fù)多次將心臟牽拉到胸腔外,造成動(dòng)物死亡率增加,加大了實(shí)驗(yàn)成本,又加大了動(dòng)物的創(chuàng)傷;阻斷冠狀動(dòng)脈造成缺血后實(shí)現(xiàn)再通時(shí),結(jié)扎線不易剪斷,常導(dǎo)致左心耳破裂,引起心臟撕脫傷,造成大出血;文獻(xiàn)報(bào)道冠狀動(dòng)脈的定位部位不一,會(huì)造成模型缺血損傷部位及損傷程度不一致等。參照不同研究人員采用的模型制備方法[1],結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室條件對(duì)該模型制作進(jìn)行了改進(jìn),以提高模型制備成功率?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 清潔級(jí)SD大鼠,體重220-260 g,雄性,合格證號(hào):SCXK(粵)2008-0020。由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將大鼠隨機(jī)分為 3組:假手術(shù)組(Sham組),僅穿線,不結(jié)扎LAD;缺血組(Ischemia組),單純結(jié)扎LAD30 min;缺血再灌注組(IR組),結(jié)扎 LAD30 min,再灌注120 min。每組20只。

1.1.2 主要儀器和器械 動(dòng)物呼吸機(jī)ALC-V8(上海奧爾科特生物科技有限公司),澳大利亞產(chǎn)Powerlab16導(dǎo)生理記錄儀,無(wú)創(chuàng)縫合針(上海醫(yī)菱醫(yī)療器械有限公司);黑色醫(yī)用縫合線、l0ml一次性無(wú)菌注射器、各種手術(shù)器械,如止血鉗、小無(wú)齒彎鉗、小鑷、小眼科剪等。

1.1.3 主要藥品 乙醚、注射用青霉素鈉、硫酸慶大霉素注射液、無(wú)菌生理鹽水注射液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 術(shù)前準(zhǔn)備及實(shí)驗(yàn)大鼠人選標(biāo)準(zhǔn) 大鼠行腹腔注射20%的烏拉坦(0.6 ml/100 g)麻醉后,仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上,行右頸總動(dòng)脈導(dǎo)管到頸總動(dòng)脈和左心室與壓力換能器相連,經(jīng)放大器測(cè)量股動(dòng)脈血壓和左心室內(nèi)壓。標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)С虒?dǎo)聯(lián)與放大器相連,記錄心電圖,用心電R波計(jì)算心率。連接心電圖,肢體導(dǎo)聯(lián)監(jiān)測(cè)心電,記錄標(biāo)Ⅱ?qū)?lián)心電圖各1 min,有異常者剔除。

1.2.2 胸部手術(shù) 插氣管接人工呼吸機(jī),胸部去毛,碘伏消毒。沿著鎖骨中線縱行切開皮膚約2cm,在第三或第四肋間用止血鉗逐層游離皮下組織、肌肉,打開胸腔,以擴(kuò)胸器擴(kuò)大胸腔,可清晰看到心臟搏動(dòng)的暗影,剪開心包,在動(dòng)脈圓錐與左心耳之間,左心耳下緣約3 mm處結(jié)扎掛線左冠狀動(dòng)脈前降支實(shí)行心肌缺血,然后迅速將心臟送回胸腔,醫(yī)用縫合線的兩端留置體外備用。用長(zhǎng)嘴止血鉗將胸部皮膚和肌肉以及心臟掛線夾緊,防止氣胸發(fā)生,觀察心電圖變化。T波高聳或者倒置為心肌缺血標(biāo)志。如心電圖改變不明顯,則稍松開止血鉗,拉緊一端線頭,則明顯看到心電圖改變。再灌注時(shí),松開止血鉗,放松掛線,形成再灌注模型。造模結(jié)束時(shí),按層次依次縫合肌肉、皮膚,切口處注射少許青霉素注射液,再次碘伏消毒,預(yù)防感染。

1.2.3 心肌缺血和再灌注模型制備成功的標(biāo)志 造模后,心電圖表現(xiàn)為ST段抬高和(或)T波高聳或者倒置呈弓背向上單向曲線為心肌缺血標(biāo)志;再灌注損傷模型成功標(biāo)志為再灌注后,抬高的ST段下降50%以上或高聳的T波下降(后期可作病理學(xué)檢查證實(shí))。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 模型制備情況 觀察各組的造模成功率。

1.3.2 心電圖改變 通過(guò)觀察心電圖ST位移值和N-ST(計(jì)算位移高于0.1 mv的數(shù)量)的改變可反映心肌缺血程度。

1.3.3 外周血中LDH、CK-MB的含量測(cè)定 缺血4 h,腹腔靜脈取血2 ml,離心,取血清,以全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)、CK-MB的含量。

1.3.4 心肌病理組織學(xué)檢查 另取結(jié)扎以下0.5 mm處心肌組織小片置4%多聚甲醛保存超過(guò)48 h。每個(gè)組織塊均酒精梯度脫水,石蠟包埋,切片厚約4 μ m,進(jìn)行蘇木素一伊紅(Haematoxylin-Eosin,HE)染色。光鏡下觀察心肌組織病理學(xué)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 模型制備情況

假手術(shù)組(Sham組),缺血組(Ischemia組),缺血再灌注組(IR組)三組,每組20只大鼠,造模成功數(shù)分別為19只,20只,18只,成功率分別為 95%、100%、90%。各組間模型鼠造模成功率的比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

2.2 對(duì)缺血大鼠心電圖的影響

IR組ST位移值和N-ST均明顯小于缺血組(與假手術(shù)組比較 P＜0.05或 P＜0.01)(表1,2),再灌注后倒置的T波變成正向抬高,有的大鼠可合并出現(xiàn)各種缺血性心律失常的心電圖表現(xiàn)。上述心電圖表現(xiàn)符合大鼠心肌缺血及再灌注損傷模型的心電圖變化,說(shuō)明此改進(jìn)造模方法是成功的。

表1 各處理組大鼠心電圖ST段(mV)、ST位移植的影響(n=20,±s)

表1 各處理組大鼠心電圖ST段(mV)、ST位移植的影響(n=20,±s)

與缺血前比較,*為P＜0.05,**為P＜0.01;IR與假手術(shù)組比較,#為 P＜0.01;與缺血組比較,Δ為P＜0.05,ΔΔ為P＜0.01

檢測(cè)指標(biāo) 組別 缺血前 缺血再灌注(min)30 60 90 120 ST位移值(MV) 假手術(shù)組 0.08±0.06 0.07±0.06 0.07±0.09 0.08±0.08 0.08±0.08缺血組 0.03±0.01 0.25±0.12** 0.29±0.14** 0.28±0.14** 0.28±0.13**IR組 0.06±0.08 0.17±0.08* 0.20±0.09* 0.20±0.08* 0.21±0.08**ST位移值(%) 假手術(shù)組 0±0 0.02±0.01 0.03±0.02 0.03±0.02 0.03±0.02缺血組 0±0 0.22±0.13 0.27±0.14# 0.26±0.14# 0.26±0.13#IR組 0±0 0.14±0.04 0.14±0.07 0.15±0.05 0.15±0.02

2.3 再灌注對(duì)缺血大鼠血清酶(LDH,CK-MB)水平的影響

再灌注后可降低心肌缺血大鼠血清LDH和CKMB水平,其中指標(biāo)CK-MB變化最為顯著,與缺血組比較(1 109±245 U/L Vs 1 513±335 U/L)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 心肌病理組織學(xué)檢查

假手術(shù)組:心肌細(xì)胞排列整齊、無(wú)變性、間質(zhì)無(wú)水腫、出血。缺血組:心肌細(xì)胞排列紊亂、局部變性、間質(zhì)水腫、出血明顯可見,心肌肌漿呈嗜伊紅染色,橫紋模糊不清或消失,肌纖維及肌絲明顯紊亂,間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。IR組:水腫、變性較缺血組減輕,心肌纖維素紊亂,局部呈波紋狀改變,部分肌纖維溶解液化,心肌間質(zhì)可出現(xiàn)少量紅細(xì)胞(圖1)。

圖1 心肌病理組織學(xué)檢查

3 討論

急性心肌梗死是心血管疾病中致死率最高的疾病,減少其發(fā)生率、降低其死亡率、改善患者生活質(zhì)量,是當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn),其中研究最多的是心肌缺血再灌注損傷[2]。目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用最廣泛的方法是結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支所致局灶性心肌缺血,通過(guò)狹窄或完全閉塞冠狀動(dòng)脈,使其供應(yīng)區(qū)血流減少或缺如,造成心肌缺血。心肌因缺血、缺氧而發(fā)生代謝紊亂以致發(fā)生凝固性壞死,其發(fā)病過(guò)程與機(jī)制和臨床相似。

傳統(tǒng)制備大鼠心肌缺血再灌注模型方法主要有兩種[3]:使用人工呼吸的心臟原位結(jié)扎和胸腔外結(jié)扎。后者模型的優(yōu)點(diǎn)是心臟被拉到胸腔外,操作可視性強(qiáng),但是在進(jìn)行心肌缺血預(yù)處理實(shí)驗(yàn)時(shí),需要反復(fù)多次將心臟牽拉到胸腔外,常常會(huì)造成動(dòng)物死亡,加大了實(shí)驗(yàn)成本。前者是在由呼吸機(jī)維持呼吸的條件下,開胸暴露心臟后,通過(guò)推管或壓管阻斷冠狀動(dòng)脈造成缺血,缺血一定時(shí)間后去掉管恢復(fù)血液灌注。這種方式的優(yōu)點(diǎn)手術(shù)操作是在呼吸機(jī)的引導(dǎo)下完成,可有充裕的時(shí)間進(jìn)行操作,且心臟處于正常解剖位置,對(duì)心臟生理功能影響較小;缺點(diǎn)是由于在胸腔內(nèi)進(jìn)行結(jié)扎冠狀動(dòng)脈的操作,視野小、心臟不易固定。我們?cè)谇罢呋A(chǔ)上,利用擴(kuò)胸器擴(kuò)大胸腔術(shù)野,然后在動(dòng)脈圓錐與左心耳之間,左心耳下緣處結(jié)扎掛線左冠狀動(dòng)脈前降支實(shí)行心肌缺血,然后將心臟送回胸腔,縫合線的兩端留置體外備用。用止血鉗將胸部皮膚和肌肉以及心臟掛線夾緊,防止氣胸發(fā)生,觀察心電圖變化。如心電圖改變不明顯,則稍松開止血鉗,拉緊一端線頭,則明顯看到心電圖改變。再灌注時(shí),松開止血鉗,放松掛線,形成再灌注模型。可如此反復(fù)多次再灌注。除去死亡和不符合模型要求者(結(jié)扎后心電圖J點(diǎn)升高不明顯),造模成功率達(dá)90%以上,較好滿足了實(shí)驗(yàn)需要。

在I/R過(guò)程中,心電圖ST段的抬高與高尖的T波融合,甚至病理性Q波的出現(xiàn),各種心律失常的出現(xiàn)都能準(zhǔn)確地反映大鼠I/R過(guò)程中心電生理的變化,因此,術(shù)前和術(shù)中對(duì)大鼠心電圖的監(jiān)測(cè)是客觀評(píng)價(jià)模型制作是否成功的標(biāo)準(zhǔn)之一。

缺血再灌注組(IR組)ST位移值和N-ST均明顯小于缺血組(與模型組比較P＜0.05或P＜0.01),心電圖表現(xiàn)為T波倒置呈弓背向上單向曲線,再灌注后倒置的T波變成正向抬高,有的大鼠可合并出現(xiàn)各種缺血性心律失常的心電圖表現(xiàn)。上述心電圖表現(xiàn)符合大鼠心肌缺血及再灌注損傷模型的心電圖變化,說(shuō)明此改進(jìn)造模方法是成功的。另外,再灌注后可降低心肌缺血大鼠血清LDH和CK-MB水平,其中指標(biāo) CK-MB變化最為顯著,與模型組比較(1 109±245 U/L Vs 1 513±335 U/L)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。從病理學(xué)上,我們可以觀察到假手術(shù)組的心肌細(xì)胞排列整齊、無(wú)變性、間質(zhì)無(wú)水腫、出血。缺血組的心肌細(xì)胞排列紊亂、局部變性、間質(zhì)水腫、出血明顯可見,心肌肌漿呈嗜伊紅染色,橫紋模糊不清或消失,肌纖維及肌絲明顯紊亂,間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與缺血組比較,IR組的心肌組織間水腫、變性較輕,心肌纖維素紊亂,局部呈波紋狀改變,部分肌纖維溶解液化,心肌間質(zhì)可出現(xiàn)少量紅細(xì)胞。

綜上所述,改進(jìn)的造模方法能夠提高造模的成功率和動(dòng)物的成活率,降低手術(shù)難度,準(zhǔn)確地復(fù)制心肌I/R的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?可靠性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好,可以供相關(guān)研究參考借鑒。

[1]張新寧,呂 琪,張永亮,等.大鼠心肌缺血再灌注模型建立方法的改進(jìn)[J].武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,17(11):941.

[2]Zhao ZQ,Corvera JS,Halkos ME,et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic post-conditioning during reperfusion:comparison with schemic preconditioning during[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003,285:H579.

[3]李 晶,鄒小華,徐向輝,等.大鼠心肌缺血后處理模型的改良及評(píng)價(jià)[J].醫(yī)學(xué)臨床研究,2008,25(12):2155.