劉 川,畢 峰,楊明妍,羅 速

(1.北華大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)一科,吉林吉林市 132013;2.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院;3.吉林省腦科醫(yī)院;4.北華大學(xué))

RNA干擾Survivin基因在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中的作用

劉 川1,畢 峰2,楊明妍3,羅 速4*

(1.北華大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)一科,吉林吉林市 132013;2.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院;3.吉林省腦科醫(yī)院;4.北華大學(xué))

目的 利用RNAi技術(shù)沉默人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞Survivin基因。方法應(yīng)用RNAi技術(shù),以pGCsi/U6質(zhì)粒為載體構(gòu)建Survivin-siRNA重組質(zhì)粒,體外轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞,通過(guò)RT-PCR檢測(cè)Survivin基因的表達(dá)。結(jié)果重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞后其生長(zhǎng)明顯受抑制;Survivin基因的表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P＜0.01),達(dá)到了抑制效果。結(jié)論RNAi可明顯降低人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中Survivin基因的表達(dá),從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng),促進(jìn)凋亡。

RNA干擾(RNAi);Survivin;神經(jīng)母細(xì)胞瘤

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1179)

神經(jīng)母細(xì)胞瘤是最常見(jiàn)的周周神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤[1],可發(fā)生于腎上腺及交感神經(jīng)部位,極易發(fā)生轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Survivin基因的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)特異性siRNA,構(gòu)建Survivin-siRNA載體,將其轉(zhuǎn)入神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中,觀察轉(zhuǎn)染后的變化,從而為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

DNA片段純化試劑盒、質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司);siRNA引物(上海生工);λ-Hind Ⅲ DNA Marker、DNA Marker DL 2000(TIANGEN);DNA Ligation Kit、RT-PCR Kit、限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ、限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、DNA Marker DL8000(上海生工);SH-SY5Y細(xì)胞(北華大學(xué)生命科學(xué)中心姜銳老師贈(zèng));pGCsi/U6質(zhì)粒(上海吉?jiǎng)P);倒置顯微鏡(olympus);電穿孔轉(zhuǎn)染儀(中國(guó)上海)。

1.2 pGCsi/U6/Survivin siRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

1.2.1 pGCsi/U6/Survivin siRNA重組質(zhì)粒的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)人Survivin基因cDNA序列(genbank:NM-001168)設(shè)計(jì)19 bp-29 bp的siRNA,其第一個(gè)堿基應(yīng)為G,GC的數(shù)量在40-50%,且不應(yīng)連續(xù)出現(xiàn)3個(gè)以上的T。故選取目的基因序列5′-GGACCACCGCATCTCTACA-3′設(shè)計(jì)DNA雙鏈(SVV-1 siRNA);同時(shí)構(gòu)建陰性質(zhì)粒序列為5′-TTCGAATCCGTCCGTACGT-3′DNA 雙鏈(SVV-2 siRNA)。pGCsi/U6載體適合于將帶有5'BamHⅠ和3'HindⅢ接頭的兩個(gè)互補(bǔ)核苷酸插入,由上海生物工程公司完成合成。

1.2.2 載體的線性化及回收 (1μg/μl)純化的DNA 質(zhì)粒 1 μl、ddH2O 15μl、10 ×buffer(10 ×)2 μl、BamH Ⅰ(10U/μl)1μl、Hind Ⅲ(10U/μl)1μl,37℃下雙酶切1 h,酶切后片段具有粘附性,再加pH為8.0的0.5mol/L的EDTA,使?jié)舛冗_(dá)10mmol/L終止,1%瓊脂糖凝膠電泳30min鑒定并回收產(chǎn)物。

1.2.3 連接、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化與篩選 由RNase去離子水、目的DNA片段、T4連接酶、10×T4 DNA Buffer和質(zhì)粒DNA載體片段構(gòu)成連接反應(yīng)體系,混勻,4℃經(jīng)16 h完成連接。再用JM109大腸桿菌制備感受態(tài)細(xì)胞,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞,篩選呈乳白色的陽(yáng)性克隆菌落(陰性多為藍(lán)色)。

1.2.4 重組質(zhì)粒的提取與鑒定 提取后質(zhì)粒行10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,觀察結(jié)果。測(cè)序鑒定。

1.3 pGCsi/U6/Survivin siRNA重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染

SH-SY5Y細(xì)胞采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液,置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)離心,用電穿孔法轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒DNA。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分三組:(1)空質(zhì)粒組;(2)陽(yáng)性重組質(zhì)粒組(siRNA-SVV-1);(3)陰性重組質(zhì)粒組(siRNASVV-2)。電穿孔條件:電壓540 V,脈寬30μs,脈沖次數(shù)3次,脈沖間隔時(shí)間1min室溫,緩沖液pH7.2,操作完成后,將電轉(zhuǎn)杯靜置10min。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到6孔培養(yǎng)板中,加入細(xì)胞培養(yǎng)液2ml,37℃5%CO2培養(yǎng)。

1.4 重組質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制

將各質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞,72小時(shí)后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí),PBS洗兩次,接種到96孔板中,每孔200μl。將各孔加入濃度為5 g/LMTT20μl,溫箱孵育4 h。加入150μl的DMSO,微振蕩器振蕩 10min,酶聯(lián)檢測(cè)儀上測(cè)波長(zhǎng)570 nm的吸光度(A)值。細(xì)胞存活率%=(實(shí)驗(yàn)組A均值/對(duì)照組A均值)×100%。

1.5 Survivin抑制效應(yīng)的檢測(cè)

提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA,以β-actin為對(duì)照,根據(jù)Survivin基因序列設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,1.5%瓊脂糖凝膠電泳(含0.5μg/ml溴化乙錠),室溫,電泳30min。

2 結(jié)果

2.1 pGCsi/U6質(zhì)粒的線性化pGCsi/U6經(jīng)BamHⅠ、HindⅢ雙酶切線性化,結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 重組質(zhì)粒PCR電泳鑒定10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果挑選1個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序,合成的siRNA序列正確,并克隆于pGCsi/U6的BamHⅠ、HindⅢ兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間(217 bp-279 bp),該序列位于U6啟動(dòng)子的下游,重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.4 重組質(zhì)粒抑制SH-SY5Y細(xì)胞的生長(zhǎng)將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染96孔板內(nèi)生長(zhǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞,72小時(shí)后倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況,空質(zhì)粒組及陰性重組質(zhì)粒組細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好,大多數(shù)細(xì)胞貼壁,細(xì)胞胞體及突觸狀態(tài)良好;陽(yáng)性重組質(zhì)粒組SH-SY5Y細(xì)胞大多懸浮,突觸消失。MTT法測(cè)SHSY5Y細(xì)胞24-72 h生長(zhǎng)狀況,發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性重組質(zhì)粒能明顯抑制SH-SY5Y的生長(zhǎng),并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性,抑制率高達(dá)50.4%,表明siRNA-SVV-1可抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞的生長(zhǎng)。

2.5 Survivin抑制效應(yīng)的測(cè)定RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞SurvivinmRNA,β-actin在各組間表達(dá)無(wú)明顯差異,siRNA-SVV-1組 Survivin/β-actin灰度比0.15,顯著低于空白組、空質(zhì)粒組和 siRNA-SVV-2組的Survivin/β-actin灰度比0.97、0.95和0.88,抑制率為88.72%,與對(duì)照組間存在顯著差異(P＜0.01),而空白組、空質(zhì)粒組和siRNA-SVV-2組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。達(dá)到了抑制Survivin基因的效果,結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖1 pGCsi/U6質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和H indⅢ酶切線性電泳圖

圖2 重組質(zhì)粒PCR鑒定圖

圖3 重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定圖

圖4 RT-PCR電泳檢測(cè)結(jié)果圖

3 討論

腫瘤的形成的不僅僅是增值過(guò)度,其凋亡同樣存在異常,Survivin基因是凋亡抑制蛋白(Inhibitor of Apoptosis,IAP)家族的獨(dú)特成員,在大多數(shù)腫瘤組織及胚胎組織中高表達(dá)[2]。目前RNAi已被廣泛應(yīng)用于基因功能以及基因治療研究[3,4],本實(shí)驗(yàn)針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)特異性siRNA,外源性基因片段插入到pGCsi/U6質(zhì)粒的BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)之間,構(gòu)建重組載體,基因測(cè)序顯示重組質(zhì)粒在序列、方向、長(zhǎng)度方面與設(shè)計(jì)目的一致。經(jīng)轉(zhuǎn)化后完成重組載體的體外基因克隆,再轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h后經(jīng)RT-PCR檢測(cè),結(jié)果顯示重組質(zhì)粒可導(dǎo)致Survivin基因沉默。RNAi技術(shù)作為基因診斷、治療新的手段具有很高的潛力,對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SHSY5Y細(xì)胞的Survivin基因有抑制作用,可能為今后神經(jīng)母細(xì)胞瘤的基因治療提供新方法、新靶點(diǎn)。

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[4]Silva J,Chang K,Hannon GJ,et al.RNA-interference-based functionalgenom ics inmammalian cells:reversegenetics com ing of age[J].Oncogene,2004,23(51):8401.

The Function of RNAiSurvivin Gene on SH-SY5Y Cells in Human Neuroblastoma

LIUChuan,BIFeng,YANGMing-yan,et al.(Department of Neurology,Affiliated Hospital of Beihua University,Jilin132013,China)

ObjectiveTo inhibit Survivin on SH-SY5Y cells of human neurob lastoma by using RNAi technology.MethodsConstructing Survivin-siRNA in vitro transfection SH-SY5Y cells on the basis ofpGCsi/U6 by using RNAi technology,then testing the growth of the cells and theexpression stateof Survivin by themethod of RT-PCR.ResultsThegrow th of recombinant transfected SHSY5Y cells is obviously inhibited;Theexpression of Survivin is obviously lower than the contrastgroup(P＜0.01),achieving the inhibitory effect.ConclusionTheexpression of Survivin in SH-SY5Y cells can reduce in human neurob lastomaby using RNAi technology,thus inhibit the cell grow th and promote apoptosis.

RNAi;Survivin;Neuroblastoma

R739.4

A

1007-4287(2010)08-1179-03

*通訊作者

2009-04-09)