李一帆,陳 東,張大威,薛 輝,劉佳梅

(1.吉林大學白求恩醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室,吉林長春 130021;2.長春中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院解剖教研室;3.廣東醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室;4.吉林大學白求恩醫(yī)學院機能科學實驗平臺)

急性大鼠脊髓損傷Allen's法模型的改良及電生理評價

李一帆1,2,陳 東1,3*,張大威4,薛 輝1,劉佳梅1

(1.吉林大學白求恩醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室,吉林長春 130021;2.長春中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院解剖教研室;3.廣東醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室;4.吉林大學白求恩醫(yī)學院機能科學實驗平臺)

目的 建立一種更實用、標準、可靠的急性大鼠脊髓撞擊損傷模型,為脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)的進一步研究奠定基礎。方法將36只成年雌性Wistar大鼠隨機分成三組,每組12只。脊髓損傷(SCI)組:用自制改良的Allen's撞擊器,以60gcm致傷力損傷大鼠T10胸椎對應脊髓。假手術組:只打開椎板,暴露脊髓,不造成SCI。正常對照組:正常大鼠,不做任何處理。各組定期行為學觀察(BBB評分),術后30天進行組織學觀察和神經(jīng)電生理檢測。結果HE染色:假手術組與正常對照組基本一致的。SCI組可見灰、白質(zhì)組織結構不完整,損傷區(qū)可見大片壞死灶、細胞腫脹。BBB評分:假手術組術后1周功能恢復接近正常。SCI組術后第2周開始恢復,到第3周基本停止,最終BBB評分未超過6分,兩組比較有明顯差異。神經(jīng)電生理(SEP,MEP)檢測:SCI組可以明顯看到SEP與MEP的峰-峰值急劇降低,且潛伏期明顯延長,差異顯著(P＜0.01)。結論改良后的急性大鼠脊髓損傷模型制作法操作簡便、重復性好,是較為理想的方法。

動物模型;脊髓損傷;BBB評分;電生理;改良

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1169)

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是交通、工礦事故及運動意外中常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病,損傷所致的截癱嚴重影響傷者的身心健康,目前,脊髓損傷模型繁多,但尚無統(tǒng)一的分型[1,2]。建立一個標準、理想的SCI實驗模型,是進行SCI基礎研究的前提。本研究在Allen's打擊法的基礎上進行了一些改進,以建立一種更標準化、理想化的大鼠脊髓撞擊損傷模型。

1 材料與方法

1.1 材料

脊髓打擊裝置:自制改良的Allen's撞擊器,均由不銹鋼材料制成,擊打棍直徑4.0mm,打擊頭呈凸形,重量20 g,擊打棍套管內(nèi)直徑4.1mm,套管外側面有刻度標記,可以調(diào)整擊打棍下落高度,范圍為3-10 cm。

1.2 動物及分組

36只體重200～250 g雌性健康的Wistar大鼠,由吉林大學白求恩醫(yī)學院實驗動物中心提供。常規(guī)飼養(yǎng)于安靜通風環(huán)境下,室內(nèi)溫度20～23℃,濕度50%～65%,飼養(yǎng)3 d后手術。動物隨機分三組,每組12只。正常對照組,不做任何處理;假手術組,只打開椎板,暴露脊髓,不造成SCI;脊髓損傷(SCI)組,按下列方法制作模型。

1.3 模型制作及術后護理

所有器械經(jīng)高壓蒸汽滅菌。取正常雌性Wistar大鼠,體重 200～250 g,用10%水合氯醛作腹腔麻醉(0.35 m l/100 g),將大鼠俯臥,固定于大鼠固定板上,在背部脊髓兩側觸摸大鼠最下肋與軟組織分界處(浮肋與第13胸椎連接處)作為骨性定位標志,向上、下5 cm范圍備皮、脫毛后用碘酊、酒精常規(guī)消毒,鋪無菌手術單,在后正中線做縱行切口,大約3 cm,依次切開皮膚、皮下筋膜,暴露椎旁肌,肉眼觀察,可見椎旁肌表面銀白色腱膜,兩側腱膜在后正中線最接近處,約平對第10胸椎棘突,用玻璃分針鈍性剝離肌肉暴露棘突、椎板和橫突。參考定位:T9棘突傾向尾側,T10棘突中立位,T11棘突傾向頭側[5]。確定T10胸椎位置,用骨剪在T9與T10、T10與T11棘突及相應椎板之間分別做兩個橫行剪口,再在T10胸椎兩側,橫突與椎板連接處做縱行剪口,形成一個方形剪口界線,然后用咬骨鉗咬住T10胸椎棘突用力拉起即“揭蓋”,去除T10椎板,形成方形骨窗,修整骨窗邊緣,充分暴露T10對應的脊髓。用自制改良的Allen's撞擊器制備脊髓損傷動物模型,打擊時,用拉鉤拉開脊髓兩側軟組織,牽拉固定,使脊柱穩(wěn)定,不受呼吸運動影響,使20 g重量的擊打棍從3 cm高度自由落體,致傷能量60 g?cm,撞擊T10骨窗對應的脊髓,造成急性脊髓損傷,擊打脊髓后,擊打棍不動,停留3min再移開。撞擊成功標準為:撞擊脊髓組織水腫、出血,硬脊膜完整呈紫紅色,緊張,膨隆,大鼠尾巴出現(xiàn)痙攣性擺動,雙下肢軀體回縮樣撲動,呈遲緩性癱瘓。常規(guī)分層縫合后回籠飼養(yǎng)。7 d內(nèi)單獨飼養(yǎng),7 d后5只合籠飼養(yǎng)。自然光照,定時定量給以軟飼料喂養(yǎng),飲水不加限制,飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～23℃,濕度50%～60%。術后開始每日腹腔注射青霉素 8萬U/只,慶大霉素0.2萬U/只,預防術后感染,維持7 d。術后人工排尿,左手撐起小鼠腹部,右手觸摸找到充盈的膀胱,然后按住膀胱底部,自上而下地輕柔擠壓,逼尿排出。擠壓膀胱后,及時清理會陰,使其保持干燥,并時常改變體位。如此人工排尿每日2次,直到動物自身排尿反射恢復。每2～3 d更換一次墊料。大鼠共計死亡1只,出現(xiàn)在SCI組術后20 d,解剖后發(fā)現(xiàn)死因為腸梗阻,隨后補充SCI組1只入實驗。

1.4 檢測指標

1.4.1 組織學觀察 每組飼養(yǎng)30 d后,各取6只大鼠,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后,將大鼠固定于固定板上,生理鹽水、4%多聚甲醛常規(guī)灌流固定,暴露脊髓T8～T12,迅速取出脊髓組織,4%多聚甲醛后固定4 h,梯度蔗糖脫水,放入OCT中室溫浸10 min,包埋,入冷丙酮中冷凍后,-70℃保存。用恒冷箱切片機做冠狀面切片,厚16μm,行HE染色。

1.4.2 行為學觀察 參照Basso等提出并改良的脊髓損傷大鼠功能恢復評判標準即 BBB評分法[6,7](共21級),雙盲法對各組動物后肢運動能力進行評估,每隔3日定時記錄大鼠雙后肢運動功能恢復情況。

1.4.3 神經(jīng)電生理檢測 術后30 d,每組取剩余9只大鼠,做感覺誘發(fā)電位(SEP)和運動誘發(fā)電位(MEP)檢測。將受檢大鼠用10%水合氯醛作腹腔麻醉,在頭顱后部,消毒皮膚,切開頭顱后部皮膚,剝離骨膜,用牙科鉆在右側皮層中央后回感覺區(qū)相對應的冠狀縫后3mm,失狀縫旁1mm處鉆一盲孔;左腿部剪毛,并暴露左腿坐骨神經(jīng)。用Powerlab誘發(fā)電位儀,BL-410生物機能實驗系統(tǒng),刺激參數(shù):粗電壓 ,強度 3V,波寬1ms,頻率 10 Hz,增益 20 倍 ,濾波300Hz,時間常數(shù)0.01 s,掃描速度6.25 ms/div。檢測感覺誘發(fā)電位(SEP)時,刺激電極位于坐骨神經(jīng),記錄電極置于皮層,負極置于頭皮下參考電極插于椎旁肌,信號計算機連續(xù)疊加100次,方能記錄到該誘發(fā)電位;檢測運動誘發(fā)電位(MEP)時,刺激電極與記錄電極交換,參考電極位于硬腭下。所有大鼠檢測完后測量其潛伏期和峰-峰值,進行統(tǒng)計學分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析和處理

采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,組間比較采用完全隨機設計資料的方差分析,檢驗標準P＜0.01。

2 結果

2.1 大鼠脊髓組織學觀察

HE染色可以觀察到假手術組灰、白質(zhì)組織結構基本完整,神經(jīng)細胞在灰質(zhì)中分布均勻、胞體飽滿、形態(tài)正常、細胞膜完整,白質(zhì)內(nèi)神經(jīng)纖維排列整齊,細胞間質(zhì)均勻。SCI組可見灰、白質(zhì)組織結構不完整,損傷區(qū)灰質(zhì)可見大片出血、大片壞死灶、細胞腫脹、有的出現(xiàn)囊腔,白質(zhì)內(nèi)神經(jīng)纖維排列不規(guī)則(圖1、2)。

2.2 大鼠行為學觀察

手術前所有實驗動物雙后肢BBB評分均為21分。假手術組大鼠術后第1天,后肢出現(xiàn)短暫性活動遲緩,第2天功能明顯恢復,且恢復速度很快,1周后功能恢復接近正常,BBB評分接近20分,2周后功能恢復BBB評分達到21分。說明椎板的咬除對脊髓有一定的傷害,但這種損傷程度是短暫的,輕微的,大鼠的后肢運動功能可迅速恢復。所有SCI組大鼠在撞擊脊髓損傷后都出現(xiàn)雙后肢癱瘓,只能用前肢拖著軀體移動,均造模成功。術后1周內(nèi)未見功能恢復,2周開始恢復,但恢復緩慢,到第3周基本停止,只能恢復到后肢3個關節(jié)的廣泛活動而不能持重行走,SCI組與假手術組有明顯差異(P＜0.01),而假手術組與正常對照組3 d后對比未見差異(表1)。

圖1 假手術組脊髓冠狀面,HE染色×100

圖2 SCI組脊髓冠狀面HE染色×100

表1 各組后肢運動功能的BBB評分比較(n=12,±S)

表1 各組后肢運動功能的BBB評分比較(n=12,±S)

*P＜0.01 vs.SCIgroup;#P＜0.01 vs.Sham group

組別 3天 6天 9天 12天 15天 18天 21天 24天 27天 30天正常對照組 21*# 21* 21* 21* 21* 21* 21* 21* 21* 21*假手術組 9.42±0.37*19.56±0.76*20.13±0.82*20.88±0.11* 21* 21* 21* 21* 21* 21*SCI組 0 0.68±0.59 1.85±0.68 2.42±1.03 3.71±1.15 4.69±1.46 5.14±1.27 5.56±1.03 5.56±1.03 5.56±1.03

2.3 神經(jīng)電生理檢測

從表2、3以及圖3、4可以看出假手術組SEP與MEP的峰-峰值和潛伏期與正常大鼠相比未見差異,說明椎板的打開對脊髓上、下行傳導通路基本沒有影響,而SCI損傷組可以明顯看到SEP和MEP的峰-峰值急劇降低,且潛伏期明顯延長,與假手術組和正常對照組相比,差異顯著(P＜0.01)。

表2 各組SEP-感覺誘發(fā)電位潛伏期與峰-峰值比較(n=9,±S)

表2 各組SEP-感覺誘發(fā)電位潛伏期與峰-峰值比較(n=9,±S)

*P＜0.01 vs.SCIgroup

組別 潛伏期(mS) 峰-峰值(mV)正常對照組 2.06±0.02* 0.16±0.01*假手術組 2.05±0.02* 0.15±0.01*SCI組 5.23±0.26 0.03±0.01

表3 各組MEP-運動誘發(fā)電位潛伏期與峰-峰值比較(n=9,±S)

表3 各組MEP-運動誘發(fā)電位潛伏期與峰-峰值比較(n=9,±S)

*P＜0.01 vs.SCIgroup

組別 潛伏期(mS) 峰-峰值(mV)正常對照組 2.02±0.02* 80.79±0.55*假手術組 2.01±0.02* 80.76±0.53*SCI組 4.73±0.35 5.95±1.03

圖3 各組SEP波形

圖4 各組MEP波形

3 討論

A llen's打擊法以一定力量撞擊脊髓后造成脊髓水腫、缺血,并繼發(fā)一系列損傷反應致脊髓損傷的典型表現(xiàn),這種模型比較接近人類SCI的病理生理特點及變化規(guī)律,但是也存在一定的缺點,例如在原先的Allen's打擊法中,雖然模擬了致傷時的最初打擊狀態(tài),卻忽略了持續(xù)性的擠壓作用,而在人類急性SCI往往因脊柱骨折存在著持續(xù)性的擠壓作用[8]。同時因重物下墜撞擊脊髓的瞬間脊柱和脊髓的不穩(wěn)定及脊髓的偏向移位導致?lián)p傷的程度就有差異等。本實驗改良的Allen's撞擊器,擊打棍直徑4.0mm,擊打棍套管內(nèi)直徑4.1mm,可以使擊打棍做自由落體運動,而不會發(fā)生位置偏移,能夠準確擊中目標區(qū)域,擊打后擊打棍停留3min,與臨床SCI損傷更加接近,同樣的勢能保證損傷程度一致;擊打棍套管外側面有刻度標記,可以調(diào)整擊打棍下落高度,范圍為3-10 cm,通過選擇擊打棍下落的高度,改變致傷勢能的大小,復制出不同損傷程度的SCI模型。

目前國內(nèi)外在選用大鼠作脊髓損傷模型時,損傷節(jié)段大多數(shù)選擇胸段,但是在具體節(jié)段選定上,從T6-T12不一。本實驗選擇T10胸椎對應區(qū),主要理由一是在臨床上胸段為脊髓損傷最常見部位;二是在T10部位能夠精準定位,保證模型損傷定位的一致性。在手術方法上本實驗采用骨剪與咬骨鉗聯(lián)合“揭蓋”,開骨窗的方法,這樣可以很好的保護骨窗下面的脊髓,有效的避免了去除椎板過程中對脊髓造成的額外損傷,此方法操作簡單,出血少,還可以保持硬脊膜的完整性,防止腦脊液外流,同時防止結締組織、組織間液、細菌或其他有害物質(zhì)的侵入。

神經(jīng)電生理檢查包括感覺誘發(fā)電位(SEP)和運動誘發(fā)電位(MEP),主要是反映SCI后神經(jīng)傳導功能。自Singer(1970)首次報道以來,誘發(fā)電位在SCI后的療效評估及功能評定方面的重要性逐漸被人們認識[9],作為更加客觀和敏感的一種檢測方法已經(jīng)越來越多地應用于臨床SCI神經(jīng)功能評價[10]。MEP是評價下行運動傳導通路功能狀態(tài)的敏感手段,能直接反映脊髓下行傳導束或外周運動神經(jīng)的功能狀態(tài),并且與下肢運動功能有較強的相關性[11];SEP反映位于脊髓背索的上行傳導通路的功能狀態(tài),兩者結合可有效檢測脊髓損傷節(jié)段的損傷程度以及損傷后功能恢復程度。目前許多監(jiān)測者采用波幅較基準下降50%,潛伏期較基準延長10%作為異常判定標準[12]。誘發(fā)電位的波幅反應誘發(fā)電位的強度,當傳導束受損時,表現(xiàn)為波幅降低,峰-峰值減小。潛伏期反應神經(jīng)纖維膜的傳導功能,在傳導束受損時,可以使傳導速度減慢,出現(xiàn)潛伏期延長。本實驗用SEP和MEP來檢測脊髓感覺和運動傳導功能,發(fā)現(xiàn)SCI組無論是感覺傳導還是運動傳導功能均未得到明顯恢復,與假手術組及正常對照組相差甚遠,受試大鼠MEP的結果與其后肢運動功能BBB評分一致,假手術組與SCI組的BBB評分結果相比較,具有顯著性差異,而這兩項結果與大鼠脊髓組織學觀察結果相吻合。上述結果,為利用該改良法成功制作急性大鼠脊髓撞擊損傷模型提供了實驗依據(jù)。

總之,該改良法克服了Allen's打擊法存在的外力作用時間不恒定、脊髓損傷程度相差大、范圍不一致、打擊點易偏移等缺陷。此方法能夠?qū)崿F(xiàn)定時、瞬時、定點、定高打擊,操作簡單,受人為因素干擾小,精確度高。只要脊髓暴露適當,打擊時可以達到100%的成功率。目前應用本方法已經(jīng)取得不少應用成果,本模型制作方法朝著精確、可控制、可重復及可定量的方向發(fā)展,使動物模型的建立更標準化、理想化,極大的提高了實驗組間的可比性,更有利于對治療效果的量化分析和研究比較。

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Improvement and eletrophysiology assessment of the rats allen'smodel for acute spinal cord injury

LIYi-fan,CHEN Don,ZHANGDa-wei,eta l.(Norman Bethune School of Basic Medical Science,Jilin University,Changchun130021,China)

ObjectiveTo establish amore practical,standard and dependablemodel for rats acute spinal cord in jury and to lay the foundation of further research on spinal cord injury(SCI).MethodsThirty-six female ratswere randomly assigned to 3 groups(n=12 pergroup).SCIgroup:SCIwas created with amodified impingerof Allen's by a 60gcm impacting on the T10 spinal cord.Sham group:neural scutewas opened only and spinal cord was exposed without SCI.Normal control group:normal rats.Ethological observation(BBB scores)was done regularly.Histological and electrophysiological tests were done on the 30th day after operation.Resu lts HE staining resultsin Sham group and Normal control groupwere identical,butSCIgroup showed fragmented construction in greymatter and necrosis,and cellular swellingwas detected in injured region.BBB scores revealed thatnearly full functional recovery after operation in Sham group required 1Week.In SCIgroup functional recovery began in 2 ndweek after operation and stop in 3 rd week,and the scores failed toexceed 6 in the final.Significantdifference lay between Sham group and SCIgroup(P＜0.01).Electrophysiological(SEP,MEP)demonstrated that peak-to-peak value dropped sharply and latency was extended obviously in SCI group.ConclusionThismethod can be regarded as a simp ler and idealway whichwasingood reproducibility toestablish the ratsmodel for acute SCI.

Ratsmodel;Spinal cord injury;BBB score;Electrophysiology;Modification

1007-4287(2010)08-1169-04

國家自然科學基金資助課題(30970739)吉林省科學技術廳科技發(fā)展計劃項目資助(20090726)

*通訊作者

R683.1;R687.32

A

2009-08-07)