薛晶 肖麗英 周學東

（口腔疾病研究國家重點實驗室，四川大學，四川 成都 610041）

隨著生命科學研究的不斷發(fā)展，人類邁入后基因組時代。人體的健康決定于基因與環(huán)境的相互作用，目前大量的研究集中在分析人的基因組成與疾病易感性和藥物敏感性的關(guān)系上。但是，在體內(nèi)發(fā)揮作用、影響人們生老病死的不僅有人的基因，還有大量的共生微生物的基因，其遺傳信息的總和稱為微生物組。只有人體基因組與微生物組“和諧一致，協(xié)調(diào)行動”才能保證人體的健康。因此，在研究基因與人體健康關(guān)系時一定不能忽略共生微生物的基因。2007年12月美國《科學》雜志預(yù)測：人體共生微生物的研究將可能是國際科學研究在未來取得突破的7個重要領(lǐng)域之一。本文將簡要介紹人體微生物組、人體口腔微生物組以及微生物基因研究新技術(shù)的最新進展。

1 人體微生物組

在人體內(nèi)部或體表活躍著數(shù)以萬計的微生物個體，包括細菌、古細菌、真菌和病毒等。這些微生物占人體總身體質(zhì)量的1%～2%，數(shù)量估計是人體細胞和生殖細胞數(shù)量的10倍，它們對人體的健康有著至關(guān)重要的作用，如幫助消化食物、合成維生素等，而同時還有一些微生物則可能導(dǎo)致疾病。這些生活在人類體內(nèi)的微生物被稱為微生物群，它們的基因組被定義為微生物組。人體微生物組的概念最先由Lederberg等[1]提出，指的是在人體內(nèi)或者表面存在的生態(tài)群落中共生、共棲和致病的微生物的總稱。如果將人定義為一個微生物和人體細胞的復(fù)合體，人類基因的范疇就包括人類基因組和微生物組的組合，人的新陳代謝功能也混合了人和微生物的特性，人類是由細菌和人體細胞共同組成的一個“超生物體”。

目前對健康和疾病狀態(tài)下這些細菌、真菌和其他微生物的作用還所知甚少。最近的研究顯示，微生物在疾病方面，如潰瘍、心臟病和肥胖癥等中扮演著重要的角色。為揭示人體健康、疾病狀態(tài)與人體微生物組的關(guān)系，美國國立衛(wèi)生研究院（national institutes of health，NIH）于2007年12月19日宣布啟動一項新的基因工程——人體微生物組項目（human microbiome project，HMP）[2]。

作為NIH生物醫(yī)學研究路標計劃的一部分，NIH將在未來5年內(nèi)在HMP上投資1.5億美元。其主要目標之一是闡明微生物組及影響構(gòu)成微生物分布和進化的因素，以更好地理解人類遺傳及生理多樣性，其結(jié)果可能為當代人類進化提供一個新的視角，即：迅速發(fā)展的科學技術(shù)、人類的生活方式和生物圈發(fā)生的變革，是否影響著“微觀進化”，從而影響人類對健康和各種疾病的易感性。通過宏基因組學方法和傳統(tǒng)基因組DNA測序方法的協(xié)調(diào)應(yīng)用，HMP將為進一步研究人體相關(guān)微生物群落奠定堅實的基礎(chǔ)。

HMP的研究目標是確定個體之間是否有共同的核心人體微生物組的存在，加深對人體微生物組的變化是否與人體健康狀況相關(guān)的理解，開發(fā)實現(xiàn)上述目標所需要的新技術(shù)和生物信息學工具，處理伴隨HMP項目相關(guān)的倫理、法律和社會問題。

HMP的實施主要包括以下內(nèi)容：首先對500種新的參考細菌的基因組進行序列測序，通過合并其他國際資助項目獲得的微生物基因組信息，從而形成涵蓋大約1 000種微生物基因組的數(shù)據(jù)庫；然后研究人員將對取自于健康志愿者身體5個部位（消化道、口腔、皮膚、鼻腔和女性泌尿生殖道）組織樣本內(nèi)的微生物群落進行分析；最后將從患有特定疾病的志愿者體內(nèi)獲得樣本，從而可以將微生物組在人體特定區(qū)域的存在及變化情況與特定的疾病建立聯(lián)系。

目前人體微生物組仍是一個未知的領(lǐng)域，HMP的最終目的是通過研究獲得的數(shù)據(jù)、工具和資源更充分地了解其變化在人類健康和疾病中的作用，它的實施將對疾病的預(yù)防、診斷及治療產(chǎn)生重大的影響[3-4]。

2 人體口腔微生物組

健康人的口腔包含有超過600種不同的細菌、病毒和真菌等微生物物種，大部分可以相互關(guān)聯(lián)并形成生物膜，抵抗機械清除力或抗生素治療，但在環(huán)境變化或其他口腔情況（如個人口腔衛(wèi)生質(zhì)量）變化觸發(fā)時它們也可成為致病微生物。大量的臨床研究[5]顯示，口腔微生物群與齲病和牙周病有著密切的關(guān)系。隨著人體微生物組項目的開展，對人體口腔微生物組的研究也日漸增多，NIH牙顱頜面研究所（national institute of dental and craniofacial research，NIDCR）于2008年啟動了第一個口腔微生物組綜合數(shù)據(jù)庫——人體口腔微生物組數(shù)據(jù)庫（human oral microbiome database，HOMD）。HOMD于2008年3月25日正式對公眾開放，它是由美國波士頓福賽斯研究所和倫敦國王學院的科學家聯(lián)手建立的，對口腔細菌的類型、新陳代謝、致病能力等進行了詳細記錄，提供了它們的數(shù)千種基因。該數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)站地址為http://www.homd.org。數(shù)據(jù)庫的詳細資料將口腔細菌的DNA、蛋白質(zhì)信息和相關(guān)論文關(guān)聯(lián)在一起[6]，方便使用者查詢。

HOMD的目標是提供大約600種人體口腔原核生物物種群落的全面信息。這些微生物物種的44%可培養(yǎng)并已命名；11%可培養(yǎng)但尚未命名；還有45%無法培養(yǎng)，但可用分子生物學研究手段，通過它們的16S rRNA序列來辨認其DNA指紋。16S rRNA序列是科學家們在過去20年中用來識別微生物遺傳信息的獨特指紋。這一序列信息可以使微生物通過一個家族樹來顯示它們的相互關(guān)系。對于那些DNA已被測序的微生物，HOMD提供在線工具來查看和分析它們的基因和蛋白質(zhì)。每個數(shù)據(jù)庫中的信息類別都是相互關(guān)聯(lián)的，易于檢索、注釋，并經(jīng)常更新。HOMD提出了一個對目前未命名物種的命名方案，使菌株、克隆以及從任何實驗室探測得到的數(shù)據(jù)可以直接鏈接到一個穩(wěn)定的有名參考微生物實體。HOMD將序列信息與表型、系統(tǒng)發(fā)育、臨床和書目信息數(shù)據(jù)等相關(guān)聯(lián)。全部和部分口腔細菌的基因組序列已被確定為HOMD項目和人體微生物組項目的一部分，HOMD同時提供可方便查看所有公開口腔細菌基因組的工具[7-8]。

NIDCR Lawrence Tabak博士認為，HOMD的建立填補了尖端研究的需要，口腔微生物組包含極其豐富的數(shù)據(jù)，HOMD未來將成為科學家查看和檢索口腔微生物群信息、形成新的科學假設(shè)和獲得計算發(fā)現(xiàn)的重要搜索引擎，并最終開發(fā)出更完善的生物治療方法來控制口腔疾病[9]。

除了HOMD外，人們還開展了對正常人口腔唾液微生物組和核心微生物組的研究。Nasidze等[10]學者分別從北美、南美、歐洲、亞洲以及非洲等不同地區(qū)提取了120個人的唾液樣本，通過對這些唾液樣本的14 115個16S rRNA基因進行測序和分析，結(jié)果識別出了101種已知的細菌類，其中有39種是從未在口腔中發(fā)現(xiàn)過的。此外，還至少發(fā)現(xiàn)了64種未知的細菌類。這些研究結(jié)果提示口腔微生物組因個體的不同在組成上也存在著很大的差異，并且不受任何地區(qū)結(jié)構(gòu)的影響。研究旨在建立健康個體唾液細菌的范圍，以期對未來的疾病診斷提供幫助。Zaura等[11]學者利用454焦磷酸測序技術(shù)檢測了3名正常高加索人口腔內(nèi)5個部位的微生物組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常人口腔中有3 600種獨特序列，超過500種不同的分類單元或“物種級”表型和88～104種高級分類群（屬或更具包容性的類群）。每個單獨的樣品平均藏匿有266種“物種級”表型，頰部樣本多樣性最小，牙齒鄰面樣本多樣性最高。主成分分析結(jié)果顯示來源于牙面的樣本占據(jù)了所有部位的主要構(gòu)成。從3個個體微生物組測序結(jié)果分析可知，高級分類群、“物種級”表型和獨特序列都有一個較大的重疊，84%的高級分類群，75%的分類單元和65%的獨特序列至少在3個微生物組中的2個存在。這3個個體的總共6 315個獨特序列中有1 660個相同序列，這1 660個相同序列，即“核心微生物組”貢獻了66%的測序內(nèi)容，重疊的分類單元貢獻了94%的內(nèi)容，而幾乎所有的內(nèi)容（99.8%）都屬于共享的高級分類群。研究證實，不同的健康人口腔細菌大部分微生物組是相同的，提示可能存在健康口腔核心微生物組。

如何使口腔微生物組有助于健康和疾病防治吸引了許多細胞生物學家、微生物學家和免疫學家越來越多的興趣，這些研究將明確如何調(diào)控微生物群才能使其有助于維持健康，如在齲齒和牙周病中通過干擾微生物的群落動力而發(fā)揮預(yù)防作用。另一方面，相關(guān)研究人員目前也正在探討口腔微生物群和某些全身性疾病之間的聯(lián)系。

3 口腔微生物組研究新技術(shù)

對口腔微生物組的認識很大程度上依賴于研究手段。根據(jù)Staley等[12]的觀點，低于1%的微生物可以在實驗室環(huán)境下生長，提示以培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)研究口腔微生物菌群的復(fù)雜性和基因多態(tài)性具有嚴重偏差?，F(xiàn)代生物技術(shù)以DNA為基礎(chǔ)的一系列研究方法，如16S rRNA基因技術(shù)、高通量指紋技術(shù)、宏基因組學技術(shù)以及下一代測序技術(shù)，使人類可以在結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和基因多態(tài)性的意義下更清晰地研究和了解人體微生物菌群[13]。

3.1 16S rRNA基因測序技術(shù)

1985年開始應(yīng)用的PCR技術(shù)開啟了對以前未知微生物群落的非培養(yǎng)依賴性分析和鑒別，包括口腔生物膜中的常駐微生物。Woese[14]發(fā)現(xiàn)，16SrRNA構(gòu)成了原核細菌核糖體亞基的一個保守序列。所有物種的16S rRNA序列的部分區(qū)域是高度保守的，而其他區(qū)域則變化較大。保守的區(qū)域，可從基因組DNA序列擴增16S rRNA序列，而多變的區(qū)域則經(jīng)常根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育用于生物分類。因此，16SrRNA序列對基因組研究特別有用，可以幫助確定在一個給定的樣本中有哪些生物分類群的存在以及它們的豐度如何。編碼16S rRNA基因順序的保守性和多樣性使從種屬水平構(gòu)建細菌進化樹關(guān)系成為可能。16S rRNA序列可從2個方面獲得：通過宏基因組DNA樣本使用不同的引物專門地擴增獲得，也可通過宏基因組DNA序列的傳統(tǒng)全基因組鳥槍法測序隨機獲得。一般來說，第2種方法獲得的16S rRNA序列會減少，但同時消除了PCR反應(yīng)的誤差。

3.2 高通量指紋技術(shù)

采用高通量指紋技術(shù)檢測環(huán)境微生物群落，可以直接檢測從微生物群落樣本中提取的核酸，以PCR為基礎(chǔ)，如變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gelelectrophoresis,DGGE）[15]，溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）[16]，末端限制性酶切片段長度多態(tài)性（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）[17-18]。這些技術(shù)已經(jīng)被學者廣泛地用來研究人體口腔微生物的種屬。

DGGE/TGGE是一種以PCR為基礎(chǔ)的微生物群落分析方法，將特定微生物群落DNA庫中的標記基因進行PCR擴增。PCR混合產(chǎn)物進行DGGE/TGGE，不同順序成分的DNA在不同變性濃度下變性，表現(xiàn)出凝膠上的不同條帶，形成不同的條帶模式，理論上認為一個條帶就代表菌落中的一種不同種屬的細菌。實驗所獲得的指紋圖譜反應(yīng)了群落的結(jié)構(gòu)，包括其復(fù)雜性以及每一個被檢測種屬的相對含量。將凝膠上的條帶進行回收、克隆及測序，便可鑒定對應(yīng)微生物的種屬。

T-RFLP是廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物群落的評價及不同生態(tài)系統(tǒng)復(fù)雜性和基因多態(tài)性比較的替代性分子學技術(shù)，也是以PCR為基礎(chǔ)，對一定的目標基因進行PCR擴增，使用熒光標記的引物，得到有熒光標志的PCR混合產(chǎn)物。由于從不同種屬細菌擴增來的目標基因可能在不同的位置含有不同數(shù)量的限制性內(nèi)切酶片段，用特定的內(nèi)切酶水解PCR產(chǎn)物，就會產(chǎn)生不同反應(yīng)的被測微生物群落特征的條帶模式，或“指紋”。由于末端限制性酶切片段長度可由已知的16S rRNA或其他目標基因序列預(yù)知，因此建立數(shù)據(jù)庫相對較容易，每次T-RFLP所測的結(jié)果可以通過將結(jié)果峰與已有數(shù)據(jù)庫進行比較而進行便捷的闡釋。

指紋技術(shù)較16S rRNA基因測序技術(shù)雖然可對整個微生物群落進行分析，獲得微生物組的情況，然而，不同指紋技術(shù)的研究結(jié)果很難進行比較，并且不能檢測微生物的分類和功能[13]。

3.3 宏基因組學技術(shù)

“宏基因組”是由Handelsman等[19]1998年提出的，包含了比可培養(yǎng)微生物大得多的遺傳信息，其定義是生物環(huán)境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和。宏基因組目前主要是指環(huán)境樣品中細菌和真菌的基因組總和，其文庫既包括了可培養(yǎng)的和未培養(yǎng)的微生物遺傳信息，因此提供了獲得新生物活性物質(zhì)的機會。宏基因組學的基本方法是分析微生物環(huán)境中的基因組組合，直接分離未培養(yǎng)微生物基因組DNA，將其克隆到可培養(yǎng)的微生物中，最后篩選出所需的。

3.4 焦磷酸測序技術(shù)

焦磷酸測序技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種新的下一代序列分析技術(shù)，它通過核苷酸和模板結(jié)合后釋放的焦磷酸引發(fā)酶級聯(lián)反應(yīng)，促使熒光素發(fā)光并進行檢測，是一個理想的遺傳分析技術(shù)平臺，既可進行序列分析，又可進行基于序列分析的單核苷酸多態(tài)性檢測及等位基因頻率測定等[20]。焦磷酸測序技術(shù)的建立與應(yīng)用使得高通量準確測定特征序列、有效進行微生物的分型鑒定成為可能。

焦磷酸測序技術(shù)的核心是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學發(fā)光反應(yīng)，這4種酶分別為：DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶，反應(yīng)底物為5′-磷酰硫酸、熒光素，反應(yīng)體系還包括待測序DNA單鏈和測序引物。在每一輪測序反應(yīng)中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團。焦磷酸基團可最終轉(zhuǎn)化為可見光信號，并由焦磷酸測序儀器轉(zhuǎn)化為一個峰值，每個峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目是成正比的。然后加入下一種dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成。每一個dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，以熒光信號的形式實時記錄模板DNA的核苷酸序列。

4 結(jié)語

人類口腔微生物與人體始終處于動態(tài)生態(tài)平衡狀態(tài)，為維護人體的健康發(fā)揮重要的作用，也與多種口腔疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，因此，對這些微生物的基因進行全面測序和對它們的生理功能進行深入解析，可為各類疾病的預(yù)防和治療帶來全新的思路和方法。人類口腔微生物組數(shù)據(jù)庫的建立為人們了解、認知復(fù)雜的口腔微生物環(huán)境提供了一個嶄新的平臺，為各種口腔疾病的預(yù)防和治療奠定了基礎(chǔ)。

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