聞公靈 張寶朝

河南南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 南陽 473009

研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷時的炎癥反應(yīng)促進(jìn)了腦梗死的繼發(fā)性腦損害。腦缺血再灌注時在缺血灶局部存在大量炎癥因子,在腦缺血再灌注損傷早期的炎癥反應(yīng)中可能起重要促進(jìn)作用。細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)是最重要的白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞間黏附分子之一,在腦缺血再灌注損傷中的作用成為急性缺血性腦卒中研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗將通過觀察丹紅注射液對缺血再灌注腦組織中性粒細(xì)胞浸潤和對ICAM-1表達(dá)的檢測,探討丹紅注射液對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物分組及給藥 選擇體質(zhì)量為270～320 g的健康SD大鼠,雌雄各半(由河南省實(shí)驗動物中心提供),隨機(jī)分成假手術(shù)組(給生理鹽水),缺血再灌注組(給生理鹽水),丹紅(給丹紅注射液2 ml/kg)組,每組 8只,經(jīng)舌下靜脈給藥3 d后制作大腦中動脈栓塞模型。

1.2 動物模型制作 用體積分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛300mg/kg麻醉,采用 Longa等[1]的線栓法建立大腦中動脈(MCA)閉塞模型。缺血再灌注組及bFGF組均給予缺血1 h再灌注24 h,屆時灌注取腦、固定、脫水、透明、包埋。假手術(shù)組除不插線外,余同上。

1.3 免疫組織化學(xué)染色檢測ICAM-1 采用SABC法,石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,過氧化氫封閉,抗原熱修復(fù) 20min,血清封閉,滴加1∶100兔抗ICAM-1抗體(購自博士德生物公司),4℃過夜,0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate bufferad satine,PBS)洗,滴加生物素化的羊抗兔IgG 37℃孵育1 h,PBS洗,滴加ABC復(fù)合物37℃孵育 1 h,PBS液洗,DAB顯色,鏡下控制反應(yīng)時間,雙蒸水終止反應(yīng),脫水、透明、封片、顯微鏡觀察。10×40倍光鏡下,在缺血區(qū)計數(shù)5個視野,計數(shù)陽性微血管數(shù)(血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿、胞膜被染成棕黃色顆粒狀),取其均值,以陽性微血管數(shù)/高倍視野表示。

1.4 HE染色觀察白細(xì)胞浸潤計數(shù) 腦組織常規(guī)切片HE染色,每張切片用10×20倍顯微鏡下隨機(jī)選取缺血區(qū)內(nèi)的5個視野,進(jìn)行白細(xì)胞計數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 12.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較采用 t檢驗。取α=0.05作為檢驗水準(zhǔn),以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 缺血再灌注腦組織ICAM-1陽性表達(dá)血管的變化及丹紅對其的影響 假手術(shù)組未觀察到ICAM-1陽性微血管,缺血再灌注組(27.40±5.86)可見較多ICAM-1陽性微血管,在腦組織切片中ICAM-1免疫陽性染色可見于微血管的內(nèi)皮細(xì)胞上,明顯的免疫陽性染色出現(xiàn)在缺血再灌注側(cè)半球,并主要局限于缺血區(qū)。丹紅組ICAM-1(20.93±4.89)陽性微血管數(shù)較缺血再灌注組明顯減少(P＜0.05)。

2.2 缺血再灌注腦組織白細(xì)胞浸潤的變化及丹紅對其的影響 假手術(shù)組未見白細(xì)胞的浸潤。缺血再灌注組白細(xì)胞(9.53±2.47)浸潤明顯增加,其浸潤主要集中在缺血梗死灶的周圍。丹紅組(7.15±2.55)在腦缺血1 h再灌注24 h白細(xì)胞浸潤的水平較缺血再灌注組明顯降低(P＜0.05)。

3 討論

大量研究證實(shí)急性缺血后恢復(fù)血流灌注可加重細(xì)胞損害,其發(fā)生、發(fā)展與ICAM-1的作用密切相關(guān)。在腦缺血再灌注時,血管內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞上細(xì)胞間黏附分子-1表達(dá)升高,白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附力增強(qiáng),造成白細(xì)胞大量牢固黏附,白細(xì)胞集聚阻塞微血管,并釋放大量的炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子,加重腦組織損傷,并吸引更多的白細(xì)胞進(jìn)入組織,形成惡性循環(huán)。Yang等[2]研究發(fā)現(xiàn)大鼠永久性大腦中動脈閉塞后24h,缺血區(qū)皮質(zhì)ICAM-1表達(dá)顯著升高,與病灶中心區(qū)相比,損傷較輕的周邊區(qū)有濃密的ICAM-1陽性血管分布。研究還顯示ICAM-1在后毛細(xì)血管內(nèi)皮優(yōu)先表達(dá)的位置與缺血再灌注相關(guān)部位的白細(xì)胞黏附和水腫形成及粒細(xì)胞炎癥期移行位置相一致。Chop等[3]在大鼠腦缺血再灌注前應(yīng)用抗ICAM-1單克隆抗體,發(fā)現(xiàn)缺血2 h再灌注48 h腦梗死體積明顯降低。應(yīng)用中性粒細(xì)胞抑制因子能明顯減輕大鼠腦缺血再灌注后缺血半球的腦梗死體積、腦水腫和神經(jīng)病學(xué)癥狀[4]。本實(shí)驗應(yīng)用免疫組化法檢測了缺血1 h再灌注24 h腦組織ICAM-1的表達(dá),在損傷區(qū)皮質(zhì),假手術(shù)組未見ICAM-1陽性微血管,缺血再灌注組可見較多的ICAM-1陽性微血管,在病灶區(qū)及半暗帶區(qū)均可見到,應(yīng)用HE染色觀察缺血區(qū)白細(xì)胞浸潤情況,結(jié)果顯示缺血再灌注組白細(xì)胞浸潤明顯增加,其浸潤主要集中在缺血梗死灶周圍,與ICAM-I高表達(dá)區(qū)域一致。在ICAM-1表達(dá)較多的區(qū)域,形態(tài)異常神經(jīng)元增加,細(xì)胞間質(zhì)水腫明顯,說明ICAM-1參與了腦缺血再灌注損傷的病理生理過程。

丹紅注射液是由丹參和紅花兩味藥材按科學(xué)配方提取的復(fù)方中藥制劑,具有活血化瘀、通脈舒絡(luò)之功效,在腦血管疾病方面應(yīng)用廣泛,但對其復(fù)方制劑研究較少,以往的研究多著眼于單味中藥從抗氧化、抗血栓形成等角度進(jìn)行研究[5-6]。本實(shí)驗著眼于復(fù)方制劑從阻抑粒細(xì)胞黏附角度出發(fā),探討丹紅注射液腦保護(hù)作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹紅組缺血區(qū)雖仍有較多ICAM-1陽性微血管,但較缺血再灌注組相比明顯下降(P＜0.05),腦缺血1 h再灌注24 h白細(xì)胞浸潤水平較缺血再灌注組明顯降低(P＜0.05),表明丹紅注射液可抑制缺血再灌注后腦組織ICAM-1的表達(dá),減輕白細(xì)胞浸潤。

綜上所述,腦缺血再灌注病變時炎性細(xì)胞的激活、浸潤及黏附分子的合成分泌呈一種相互增強(qiáng)相互促進(jìn)的級聯(lián)反應(yīng),ICAM-1介導(dǎo)了白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附及向腦缺血區(qū)浸潤過程,丹紅注射液可以降低缺血再灌注腦組織中性粒細(xì)胞的浸潤及ICAM-1的表達(dá),提示丹紅注射液可能激活了機(jī)體的內(nèi)在保護(hù)作用,阻斷了腦缺血再灌注損傷時的炎性級聯(lián)反應(yīng),從而發(fā)揮了保護(hù)作用。

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