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        離子色譜法檢測膠紅酵母R.mucilaginosa C I CC 33013胞外多糖的單糖組成

        2019-06-25 08:35:18馬文錦李梅林張永顯于長青班省華
        農(nóng)產(chǎn)品加工 2019年12期
        關(guān)鍵詞:阿拉伯糖胞外單糖

        馬文錦,李梅林,王 博,張永顯,于長青,班省華

        (甘肅省輕工研究院有限責(zé)任公司,甘肅蘭州 730030)

        0 引言

        膠紅酵母(R.mucilaginosa) 是酵母種屬的一種,研究發(fā)現(xiàn)膠紅酵母富含蝦青素、β-胡蘿卜素和β-葡聚糖,其可以將糖蜜、三乙醇胺、二乙醇胺和一些簡單的芳香族化合物作為滿足自身生產(chǎn)的氮源[1-2]。酵母菌胞外多糖(Extracellular polysaccharides,E PS)是由酵母細胞產(chǎn)生的,分布于細胞壁之外,以莢膜的形式附到細胞壁上或以黏液的形式分泌于胞外環(huán)境的同多糖或異多糖[3],與植物多糖、動物多糖等其他來源的多糖相比,酵母胞外多糖最大的優(yōu)勢在于易于分離純化,可連續(xù)化發(fā)酵,不受地域、季節(jié)等環(huán)境的影響。因此,研究酵母胞外多糖具有較強的市場競爭力和廣闊的發(fā)展前景。

        近年來,隨著糖生物學(xué)和糖化學(xué)的發(fā)展,多糖的生物活性越來越受到人們的重視,市場上出現(xiàn)了很多多糖類藥品、食品和保健品,對這些產(chǎn)品的品質(zhì)控制也就越來越重要。由于單糖是構(gòu)成多糖的基本單元,因此單糖組成分析是基礎(chǔ)性和關(guān)鍵性的研究環(huán)節(jié)。目前,關(guān)于單糖組成的測定方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、毛細管電泳法和離子色譜法。由于糖鏈沒有紫外或者熒光基團,采用高效液相色譜法時,需將樣品水解后進行柱前或柱后衍生化處理,使糖鏈帶上紫外或者熒光基團,極性發(fā)生改變,但該方法繁瑣耗時且靈敏度低[4-5]。氣相色譜法檢測單糖時,雖然靈敏度較高,但是也要對其衍生化處理,由此容易產(chǎn)生異構(gòu)體,使一種糖產(chǎn)生幾個色譜峰,對組分的分離與定量產(chǎn)生影響[6-7]。毛細管電泳法由于對常見糖類的紫外吸收較弱,也需經(jīng)過衍生后才能使得糖類達到足夠的靈敏度[8-9]。而離子色譜法最大的優(yōu)點就是樣品不需要衍生處理,就能分析幾乎所有的單糖和大部分的寡糖及低聚糖[10-12],已經(jīng)得到越來越廣泛的應(yīng)用。通過離子色譜法檢測了膠紅酵母胞外多糖的單糖組成,為常見多糖組成中單糖的定性定量分析提供了快速可靠的方法。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        膠紅酵母菌株,中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供;葡萄糖,天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司提供;阿拉伯糖,廣州蘇喏化工有限公司提供;D-半乳糖,南京化學(xué)試劑股份有限公司提供;核糖、木糖、果糖、甘露糖,合肥博美生物科技有限責(zé)任公司提供;三氯乙酸,國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供;甲醇,海南得益化工貿(mào)易有限公司提供。

        Y C3000型離子色譜儀,青島埃侖色譜科技有限公司產(chǎn)品。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 單糖標準溶液配制

        分別配制質(zhì)量濃度均為1.00 mg/mL的阿拉伯糖、核糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、D-半乳糖等7種單糖的儲備液。

        1.2.2 膠紅酵母胞外多糖中單糖組分的測定

        試驗前期通過醇沉、脫蛋白、透析等方法得到膠紅酵母R.mucilaginosa CICC 33013菌株代謝的胞外多糖RE PS,復(fù)溶后經(jīng)D EAE-52纖維素層析和Sephadex G-100凝膠柱層析分離純化得到多糖組分RE PS2-A,高效液相凝膠滲透色譜法法測得其呈單一、對稱峰,表明得到的多糖組分RE PS2-A是均相樣品。

        在已有方法[13]的基礎(chǔ)上進行改進。具體操作為:精確稱取5.00 mg多糖組分RE PS2-A溶解于濃度為2.5 mol/L的三氟乙酸中,在121℃下保存2 h,采用N2氣流對其風(fēng)干。風(fēng)干后的樣品用甲醇進行近一步萃取、洗滌,并用N2氣流對其風(fēng)干,循環(huán)3~4次;得到的干樣品用1.00 mL的蒸餾水溶解,溶解后稀釋100倍,取25μL樣液采用離子色譜進行分析,用P A D軟件做出相應(yīng)的峰圖。設(shè)定條件如下:流動相為氫氧化鈉,流速梯度為 0~40 min,5 mmol;40~45 min,100 mmol;45~50 min,200 mmol;50.2~55.0 min,5 mmol;其中40~45 min內(nèi)同時加入100 mmol的醋酸鈉,流速設(shè)定為1 mL/min,上樣量25μL,柱溫30℃,柱型為Carbo Pac-P A10。

        2 結(jié)果與分析

        單糖標準圖譜見圖1。

        由圖1可知,在上述試驗操作下,阿拉伯糖、核糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖依次出峰,并且獲得了較好的分離效果。

        多糖組分RE PS2-A的單糖組成譜圖見圖2。

        圖1 單糖標準圖譜

        圖2 多糖組分R E PS2-A的單糖組成譜圖

        由圖2可知,由出峰時間和峰面積可得,RE PS2-A由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖4種單糖組成,摩爾比為0.2∶63.1∶18.3∶18.3。其中,半乳糖的含量占到50%以上,阿拉伯糖含量最低。

        3 結(jié)論

        建立了一種快速、靈敏度高的適合檢測多糖中單糖組分的定性定量分析方法,為闡明膠紅酵母R.mucilaginosa CICC 33013胞外多糖的結(jié)構(gòu)組成及其活性提供技術(shù)支撐及基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。此方法與傳統(tǒng)方法相比,消除了非糖類成分的干擾,提高了檢測的專屬性,結(jié)果更加真實,同時為其他類多糖的質(zhì)量控制提供了借鑒[14-15]。

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