詹越城，何 斌，劉夢婷，楊 娜，汪慶旗，楊 琳

（1.浙江公正檢驗中心有限公司，浙江杭州 310000；2.浙江贊宇科技股份有限公司，浙江杭州 310009）

膽堿是哺乳動物生長過程中不可或缺的一種水溶性維生素，它在生物體內具有不可替代的基本功能。雖然人體和哺乳動物具有合成膽堿的功能，但大量研究表明人體也需要膳食膽堿。膽堿以氯化物或酒石酸氫鹽的形式用于嬰幼兒配方食品的強化。當體內膽堿不足時，表現為生長受阻、營養(yǎng)不良、繁殖能力差和脂肪肝等。試驗證明，在嬰幼兒時期攝入適量的膽堿能夠幫助提升寶寶的記憶能力。L-肉堿是一種相對分子質量較小的類蛋白質分子，是促進脂類代謝的重要物質。若體內缺乏L-肉堿，會造成細胞能量代謝的紊亂，從而引起肌肉無力、疲勞和大量脂肪的堆積。L-肉堿對嬰兒體內脂肪代謝至關重要，有助于嬰兒保持體溫，且有助于早產兒發(fā)育，被視為嬰兒必需營養(yǎng)元素。成年人所需的膽堿、L-肉堿可由自身合成，亦可通過食物進行補充。但嬰幼兒各種功能未發(fā)育完全，自身合成量非常有限，絕大部分需通過食物得到補充[1-3]。

目前，對于膽堿的檢測方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法、離子色譜法、酶法和化學發(fā)光法等，L-肉堿的檢測方法主要有酶顯色法-分光光度法、酶-熒光法、高效液相色譜法、離子色譜法等[4-5]。國家標準中對膽堿和L-肉堿的測定方法為分光光度法，該操作較為繁瑣、耗費時間長、檢測靈敏度不高。試驗采用高效液相色譜-串聯質譜法同時測定嬰幼兒配方食品中膽堿和L-肉堿含量，具有操作簡單、檢測靈敏度高、重現性好、抗干擾性強等優(yōu)點。

1 試驗設計

1.1 儀器與試劑

乙腈、甲酸均為色譜純，美國TE DIA公司提供；冰乙酸（分析純），杭州化學試劑有限公司提供；水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。

膽堿，L-肉堿標準物質（含量≥99%），均購于德國D r.Ehrenstorfer公司。

Agilent6470型液相色譜串聯三重四極桿質譜儀，配有電噴霧（ESI） 離子源，美國Agilent公司產品；AR2140型電子分析天平、KS-300EI型超聲波清洗器，寧波海曙科生超聲設備公司產品；Centrifug-5804R型臺式離心機，德國Eppendorf產品；M illi-Q型純水儀，美國M illpore公司產品。

1.2 溶液的配制

標準溶液的配置:將上述標準物質各稱取0.10 g至50.00 mL容量瓶，用水溶解并定容，再用水溶液稀釋成系列標準工作液（現配現用）。

1.3 樣品制備

稱取奶粉1.00 g于100 mL容量瓶中，加入60 mL 45～50℃水溶解，振蕩混勻2 min，超聲提取30 min，待溶液溫度降低至室溫。向上述溶液中加入0.1 mL冰乙酸，用水定容至刻度，混勻。取30 mL至50 mL離心管中，以轉速4 000 r/min離心5 min，取上清液1.00～25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，經0.22μm濾膜過濾后，上儀器進行測定。

1.4 分析條件

色譜條件:色譜柱:O SAKA S OD A PC HILIC（5μm，2.0 mm×100 mm）；流速0.6 mL/min，柱溫40℃，進樣量2μL；流動相A 0.1%甲酸水溶液，B乙腈；流動相比例A/B=90/10（V/V） 質譜條件:離子源電噴霧離子源（ESI+）噴霧壓力40 psi；干燥氣流速10 L/min，干燥氣溫度350℃，毛細管電壓4 000 V。

膽堿和左旋肉堿的質譜優(yōu)化條件見表1。

表1 膽堿和左旋肉堿的質譜優(yōu)化條件

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優(yōu)化

選擇ESI正離子模式，質譜條件的優(yōu)化用直接接二通方式進行，用0.3 mL/min的流速將質量濃度1μg/mL膽堿和左旋肉堿標準溶液注入電噴霧離子源，進行一級質譜分析得到相應的分子離子峰，對分子離子峰進行二級質譜（子離子）掃描，獲得二級質譜信息，然后對裂解電壓及碰撞能進行優(yōu)化，使分子離子和特征子離子強度達到最佳，然后進一步優(yōu)化毛細管電壓、霧化器壓力、干燥器溫度和流速等質譜參數使離子化效率達到最佳。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

膽堿和左旋肉堿都屬于大極性親水化合物，在常規(guī)C18色譜柱上很難保留，因此需要選用親水性色譜柱進行分離。試驗比較了HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8μm） 和P C HILIC（2.0 mm×100 mm，5μm）的分離效果。結果發(fā)現，2種色譜柱對膽堿和左旋肉堿保留和分離效果都不好，但是P C HILIC保留時間更加穩(wěn)定、分離效果也較好，因此選用P C HILIC色譜柱。

因采用ESI正離子模式，流動相多使用質量分數0.1%甲酸水-乙腈，質量分數0.1%甲酸水-甲醇，濃度5 mmol/L乙酸銨-乙腈，濃度5 mmol/L乙酸銨-甲醇。結果顯示，使用質量分數0.1%甲酸水-乙腈作為流動相時，目標物響應和峰形都較好。

2.3 樣品提取方法的條件

嬰幼兒配方奶粉中含有很多水溶性成分和脂溶性營養(yǎng)成分，基質比較復雜。其中脂溶性營養(yǎng)成分不溶于水，而膽堿和左旋肉堿水溶性良好，可用溫水直接提取。所以在用水提取后，沉淀溶于水中的蛋白質就可以了。試驗考查了乙腈、乙酸、三氯乙酸、亞鐵氰化鉀/乙酸鋅等沉淀劑對嬰幼兒配方奶粉中蛋白質的沉淀效果。結果發(fā)現，用乙腈沉淀蛋白質不完全，離心過濾后樣品溶液不澄清，檢測峰形較差；亞鐵氰化鉀/乙酸鋅沉淀劑沉淀效果好，但是對左旋肉堿有影響，回收率較差；三氯乙酸和乙酸沉淀蛋白質完全，樣品溶液過濾后澄清，目標物檢測峰形較好。從操作的便捷性和安全性考慮，試驗采用冰乙酸作為蛋白質沉淀劑。

試驗比較了振蕩提取與超聲提取2種方法，結果表明，單純振蕩提取需要時間較長。振蕩1 min后超聲30 min提取效率高、提取效果好。

2.4 線性關系和檢出限的考查

在試驗所確定的色譜和質譜條件下，對膽堿和左旋肉堿進行測定，用水稀釋至適當質量濃度，以目標物質量濃度為橫坐標（X）、對應的響應值為縱坐標（Y），作線性方程。

標準溶液線性參數見表2。

2.5 方法回收率和精密度驗證

對樣品分別進行3個質量濃度6次加標回收試驗考查回收率和精密度。

回收率試驗（n=6） 見表3。

表2 標準溶液線性參數

表3 回收率試驗（n=6）

從表3可知，樣品中膽堿的平均回收率為80.3%～107.9%，相對標準偏差為3.6%～7.5%；左旋肉堿的回收率為75.4%～94.7%，相對標準偏差為6.0%～8.2%。所以，該方法具有較高的精密度和準確度。

膽堿和左旋肉堿混合標準溶液的總離子流色譜圖見圖1，正模式下多反應監(jiān)測（M R M） 模式下膽堿色譜圖見圖2，正模式下多反應監(jiān)測（M R M） 模式下左旋肉堿色譜圖見圖3。

圖1 膽堿和左旋肉堿混合標準溶液的總離子流色譜圖

2.6 實際樣品的檢測

用上述檢測方法對市售6個奶粉樣品（包括1段，2段，3段奶粉）進行了檢測，膽堿和左旋肉堿含量實測值與產品標示值進行比較，皆符合要求。

實際樣品檢測見表4。

圖2 正模式下多反應監(jiān)測（MRM）模式下膽堿色譜圖

圖3 正模式下多反應監(jiān)測（MRM）模式下左旋肉堿色譜圖

3 結論

建立了H PLC-M S/M S法同時測定嬰幼兒配方食品中膽堿和左旋肉堿的檢測方法。優(yōu)化了前處理提取、凈化、色譜和質譜條件，使其目標物與干擾物有良好的分離。該方法具有操作簡單、靈敏度高、專屬性強等特點，可用于實際檢測工作。

表4 實際樣品檢測/mg·（100 g）-1