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        豬源乳酸菌的分離、篩選、鑒定及產(chǎn)酸性能的研究

        2010-08-09 02:38:40郭志杰張德曉王曉翠
        飼料工業(yè) 2010年20期
        關(guān)鍵詞:株菌膽鹽產(chǎn)酸

        郭志杰 李 杰 李 鑫 張德曉 王曉翠

        乳酸菌在替代腹瀉、促生長、抗生素等綜合方面一定程度上起到良好的作用,被人們認(rèn)為是理想綠色添加劑。人們根據(jù)乳酸菌生理功能,將其應(yīng)用到仔豬腹瀉的防治上,起到了顯著降低腹瀉率,促生長的效果,提高了養(yǎng)豬的經(jīng)濟效益[1]。理想的益生素菌種最好來自同源動物的腸道。Timmerman等(2006)研究表明,同源性乳酸菌對宿主的益生作用優(yōu)于異源菌株[2]。由于動物種類和環(huán)境的不同定植腸道的種類和數(shù)量相差很大,定植的能力也不盡相同,相應(yīng)在糞便里也不盡相同[3]。然而得到并篩選出同源且抗逆性強的菌株尤為重要。故分離并篩選耐受性和抑菌效果良好的菌株為研究仔豬防腹瀉、促增長的微生態(tài)制劑提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料與設(shè)備

        1.1.1 病原指示菌

        大腸桿菌和沙門氏菌均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院贈送。

        1.1.2 培養(yǎng)基

        MRS液體和固體培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、LB培養(yǎng)基。

        1.1.3 生化鑒定試劑

        5%過氧化氫(v/v)、奈示試劑、PY基礎(chǔ)培養(yǎng)液、檸檬酸鐵氨、v-p試劑、明膠、細菌微量生化反應(yīng)管。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 菌株分離與命名

        取28日齡新鮮斷奶仔豬糞便0.5 g置于4.5 ml滅菌生理鹽水中,搖勻。進行梯度稀釋,稀釋至第7個梯度,吸取 10-5、10-6、10-7梯度稀釋液 200 μl于固體MRS培養(yǎng)基平板上均勻涂布。將上述平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(5%CO2)培養(yǎng) 48 h,挑去健壯、活性高的單菌落30株。反復(fù)劃線純化到獲得純菌株為止。

        進行革蘭氏染色、鏡檢。選擇革蘭氏陽性菌且無芽孢的菌株為后備菌株。將菌液與滅菌甘油按1:1混合置于-20℃冰箱進行菌種保藏。

        菌株的命名:以“乳酸菌”首字母與分離出菌株的順序來命名。如分離出的第1株乳酸菌命名為R1,分離出第8株則為R8。

        方干又有七律詩《題龍泉寺絕頂》和《再題龍泉寺上方》。據(jù)嘉泰《會稽志》:“(龍泉寺)東晉咸康二年建。唐會昌五年廢,大中五年重建。咸通二年改今額?!盵10]卷八因而可以據(jù)此判斷在咸通二年(861)方干52歲之后至少曾經(jīng)兩次造訪會稽龍泉寺并且留下詩篇。

        1.2.2 耐酸試驗

        將上述保藏菌株按5%(v/v)接種量接種,活化2到3代以保證菌株高活性,活化培養(yǎng)時間為24 h。

        將最后1次活化好的菌液按5%(v/v)接種量接入pH值2.5的MRS液體培養(yǎng)基,同時接入不加酸MRS液體培養(yǎng)基作為對照,2 h后,分別吸取酸處理和對照組菌液200 μl進行涂板,培養(yǎng)48 h后進行平皿菌落計數(shù)。計算酸處理過的存活率 A(%)=X1/X0×100,式中:A為酸處理后的存活率;X1為處理2 h后每毫升的活菌數(shù)(CFU);X0為對照組2 h后每毫升的活菌數(shù)(CFU)。

        1.2.3 耐膽鹽試驗

        在液體MRS加0.3%(m/v)豬膽鹽搖勻,方法同上述耐酸試驗。計算膽鹽處理過的存活率B(%)=Y1/Y0×100。式中:B為膽鹽處理后的存活率;Y1為膽鹽處理2 h后每毫升的活菌數(shù)(CHU);Y0為對照組2 h后每毫升的活菌數(shù)(CFU)。

        1.2.4 抑菌試驗

        大腸桿菌、沙門氏菌按5%(v/v)接種量接入LB培養(yǎng)基進行培養(yǎng),37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,涂板查數(shù)后調(diào)節(jié)原菌液107CFU/ml,同樣方法調(diào)節(jié)乳酸菌菌液濃度108CFU/ml。采用牛津杯法,吸取200 μl致病菌在營養(yǎng)瓊脂涂板,分別制成大腸桿菌板和沙門氏菌板,無菌條件下將牛津杯放在平板上然后吸取200 μl乳酸菌發(fā)酵液于杯中,每個菌株做3個重復(fù),平放37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,測其抑菌直徑,每個抑菌圈測3個直徑,取其平均值。

        目的菌株進行產(chǎn)酸驗證。把每株菌都活化2次以達到高的活性,按5%(v/v)接種量接入100 ml的三角瓶中。每株菌做3個重復(fù),即每株菌測得3個pH值,求其平均值。

        1.2.6 鑒定試驗

        首先通過菌落形態(tài)特征與顯微鏡(10×100)觀察可初步判定球或桿狀。再通過過氧化氫試驗、硝酸還原試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗、pH值 9.2和 pH值 9.6生長試驗、4%NaCI、16.5%NaCI生長試驗、細胞運動性(半固體穿刺)試驗,做出關(guān)于桿菌與球菌屬的進一步鑒別。再通過精氨酸產(chǎn)氨試驗和各類糖發(fā)酵試驗結(jié)果與《乳酸細菌的分類鑒定與試驗方法》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對照進行種的鑒定。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 菌株的分離

        試驗從新鮮斷奶仔豬糞便中分離出30株無芽孢乳酸桿菌,且30株都是革蘭氏陽性。其在MRS固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)也各異,多呈白色或乳白色還有呈半透明狀,表面大多光滑較多中央有隆起現(xiàn)象,邊緣大多整齊也有放射粗糙型。

        2.2 耐酸試驗

        通過pH值2.5處理后存活率見表1。由表1可知,R9、R11、R12、R14、R15、R18、R23表現(xiàn)出較強的耐受性,酸處理2 h后存活率仍達到30%以上;R3、R21、R22對酸也有一定的耐受性,存活率超過20%;而R25、R30此條件下較為敏感,存活分別為10.0%、10.2%;其余菌株則受到強烈的抑制。最終以存活率10%為界限,選定R3、R9、R11等13株菌進行下一步的篩選。

        表1 pH值2.5條件下30株乳酸菌存活率

        2.3 耐膽鹽試驗

        通過0.3%膽鹽濃度后存活率見表2。由表2可知,R11、R14、R15、R18、R22都表現(xiàn)出較強的耐受性;R3、R30也有一定的耐受性,其余菌株則受到強烈的抑制。最終以存活率10%為界限,選定R3、R11等7株菌進行下一步的篩選。

        表2 9株菌在0.3%膽鹽濃度存活率

        2.4 抑菌試驗

        大腸桿菌、沙門氏菌病原菌抑菌直徑見表3。由表3 可知,R11、R15、R18、R224 株菌對大腸桿菌、沙門氏菌都有較強的抑菌作用,R14處于過渡期,R3、R30抑菌能力較弱,以18 mm為界,R18在抑制沙門氏菌時沒有達到18 mm,但在繁殖以及在其它耐性方面都有強的作用,故保留其菌株。選出 R11、R15、R18、R22為篩選目的菌種。

        表3 對指示菌抑菌直徑測定(mm)

        2.5 產(chǎn)酸試驗

        4株菌產(chǎn)酸能力見表4,由表4可知,4株菌產(chǎn)酸能力都很強,且3次重復(fù)測定pH值的變化都很小。只有R18的pH值超過4.00,雖超4.00但其產(chǎn)酸能力仍很強。其中R11產(chǎn)酸能力最強,pH值達3.83。

        表4 分離菌產(chǎn)酸試驗結(jié)果

        2.6 鑒定試驗

        對4株菌首先進行屬的鑒定。通過菌落形態(tài)、鏡檢與進一步通過生化鑒定不發(fā)生過氧化氫試驗、不能硝酸還原、不能明膠液化、不能產(chǎn)生吲哚、不能產(chǎn)生硫化氫可初步判定R18、R22為乳酸桿菌屬。通過鏡檢觀察菌的排列狀態(tài)與進一步的生理生化鑒定:發(fā)酵葡糖糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,在15和45℃條件下可以生長,生長于6.5%NaCI與pH值9.6的環(huán)境可初步判定R11、R15是腸球菌屬。

        表5 2株乳桿菌種鑒定結(jié)果

        對4株菌再進行種的鑒定。通過表5與《乳酸細菌的分類鑒定與試驗方法》對照可知,R18除了在利用核糖與鑒定特征有差別外,其余與嗜酸乳桿菌相符;R22除了利用棉籽糖與鑒定特征有差別外,其余與口乳桿菌相符。通過表6與《乳酸細菌的分類鑒定與試驗方法》對照可知,R11為屎腸球菌、R15為雞腸球菌。

        表6 2株乳球菌種鑒定結(jié)果

        3 討論

        3.1 菌株的分離

        根據(jù)微生態(tài)學(xué)原理從腸道或糞便中分離乳酸菌應(yīng)用于生產(chǎn)被認(rèn)為是一種可行的方法[4]。分離菌株的同源性很重要,有報道認(rèn)為,正常菌群在動物體內(nèi)的定植是通過粘附來完成的,從某一類動物分離到的乳酸菌只對這類動物的消化道上皮表現(xiàn)出較強的粘附性,對其它動物不粘附或低粘附,而這種粘附性是關(guān)系到微生物添加劑作用效果的關(guān)鍵問題[5]。許多從雞上分離的乳酸菌只對雞小腸粘膜上皮細胞有粘附力,而對大鼠和豬等則沒有粘附力,同樣從大豬上分離的乳酸桿菌對小豬的腸粘膜上皮細胞粘附力較差[6]。益生菌菌株定植的宿主特異性直接影響到益生素制劑的應(yīng)用效果,因而菌種的分離選擇必須注意到宿主特異性問題[7]。糞便里的活菌經(jīng)過胃腸道已經(jīng)經(jīng)過逆性環(huán)境的篩選為以后的體外篩選打下基礎(chǔ)。

        試驗采用MRS瓊脂作分離乳酸菌用培養(yǎng)基,它含有較高濃度的乙酸鹽離子并有刺激因子吐溫-80,可抑制其它許多微生物生長,起到選擇的作用[8]。試驗不是在純厭氧條件下進行,而是采用5%二氧化碳濃度培養(yǎng),目的是得到對環(huán)境要求比較低,易分離、培養(yǎng)、保存的兼性厭氧菌,便于實際生產(chǎn)的應(yīng)用。

        3.2 酸耐受性

        幼齡動物胃內(nèi)的pH值一般在3~4左右,小腸內(nèi)pH值為4~5,大腸內(nèi)pH值高達5.0以上[9]。乳桿菌要進入仔豬消化道起作用,首先應(yīng)該能夠耐受較低pH值的酸性環(huán)境,因為初生仔豬胃內(nèi)pH值為5.0,幾小時后降為3.0~4.0,5周齡時pH值為2~3.0,其后相對穩(wěn)定。這種酸度對許多乳桿菌來說都是不耐受的,從外界進入的乳酸桿菌必須經(jīng)過胃的酸性環(huán)境,保持足夠的活菌數(shù)才能起作用,在本試驗中將耐酸性作為乳酸桿菌篩選的首要指標(biāo),既減少后期工作量,又保證篩選菌株能順利通過酸性胃環(huán)境,進入腸道發(fā)揮功能。

        3.3 膽鹽耐受性

        有研究表明,由肝臟分泌到十二指腸的高濃度的膽鹽具有抗菌活性,它對細胞膜有很強的破壞力,它的疏水作用可導(dǎo)致膜蛋白離解和細胞膜破裂[10]。故益生菌要順利進入動物腸道,除具有可耐受胃中低pH值的能力外,還需具備耐受小腸中膽汁等形成的高滲透壓環(huán)境的能力。小腸中膽汁鹽含量在0.03%~0.3%之間波動[11],故采用0.3%膽鹽作為篩選耐受腸道內(nèi)膽鹽的指標(biāo)。通過耐酸與耐膽鹽試驗可知,膽鹽是比胃酸對乳桿菌更不利的因素,這與趙瑞香等[12]的報道一致。

        3.4 抑菌試驗

        乳酸菌代謝產(chǎn)物抑制大腸桿菌和沙門氏菌的效果以抑菌圈的大小為指標(biāo)。牛津杯中的抗菌物質(zhì)能透過瓊脂來抑制大腸桿菌和沙門氏菌,離牛津杯越遠,能滲透過去的抗菌物質(zhì)的濃度就越小,所以抑菌圈越大,說明效果越好。7株乳桿菌對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌圈從13~21 mm不等。作為益生菌的乳酸菌菌株在體外應(yīng)具有很好的抑菌作用,故以18 mm大小的抑菌圈為標(biāo)準(zhǔn)[13]。乳酸菌代謝產(chǎn)生的酸、細菌素、過氧化氫等物質(zhì)對病原菌起到抑制或殺滅的作用。國內(nèi)外的研究報道表明,不同的乳桿菌菌株起抑菌作用的主要物質(zhì)不盡相同,有的主要是酸,有的主要是細菌素,有些是這些物質(zhì)的共同作用。與Vandenbergh報道的乳桿菌主要是通過代謝產(chǎn)生的乙酸、乳酸等抑制細菌生長的結(jié)果一致[14]。

        3.5 產(chǎn)酸試驗

        乳酸菌產(chǎn)酸功能是一個很重要的指標(biāo),酸可使胃內(nèi)蛋白酶原激活,同時酸具有強的殺菌作用,篩選出的菌都可以分泌出低的pH值。

        3.6 鑒定試驗

        對菌進行有效、準(zhǔn)確鑒定是開發(fā)和利用他們的前提條件。目前乳酸菌的分類鑒定方法很多,主要包括常規(guī)鑒定法、快速鑒定法以及分子生物學(xué)鑒定方法。而經(jīng)典鑒定法即生理生化鑒定是常規(guī)鑒定法的主要組成部分,同時也是大多數(shù)實驗室進行常規(guī)菌種鑒定應(yīng)用最多的方法。各種細菌所具有的霉系統(tǒng)不盡相同,對營養(yǎng)基質(zhì)分解能力也不一樣,因而代謝產(chǎn)物或多或少各有區(qū)別,可供鑒別細菌用。

        4 小結(jié)

        R11、R15、R18、R22對酸、膽鹽、抑菌及產(chǎn)酸性能的綜合能力較好。在pH值2.5作用后存活率分別為32.1%、61.2%、32.5%、29.2%;在含0.3%豬膽鹽MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h后存活率依次為40.1%、20.2%、22.1%、30.1%;且此4株菌株抑菌與產(chǎn)酸能力也較強;通過鑒定可知,R11為屎腸球菌、R15為雞腸球菌、R18嗜酸乳桿菌、R22為口乳桿菌。

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