仇 明 封功能 齊志濤 許 偉 楊文平 董學興 王愛民

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，放養(yǎng)密度加大，養(yǎng)殖水體環(huán)境惡化日益加劇，生態(tài)環(huán)境遭到破壞，病毒性和細菌性疾病頻繁暴發(fā)，化學藥物和抗生素的連續(xù)使用，嚴重危害著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[1-2]。微生態(tài)制劑可調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水體生態(tài)環(huán)境，避免了病原菌耐藥性的產(chǎn)生和藥物殘留，并在促生長和提高動物免疫力方面有良好效果，可望成為新型綠色、環(huán)保飼料添加劑。其中，芽孢桿菌(Bacillus)是一類好氧或兼性厭氧的革蘭氏陽性細菌，能在動物腸道內(nèi)生長繁殖，分泌產(chǎn)生多種酶類(如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等)及營養(yǎng)代謝產(chǎn)物(如多種氨基酸和維生素類物質(zhì)等)，并具有抗菌性能好、良好的穩(wěn)定性及對水產(chǎn)動物的益生作用和改善水產(chǎn)品質(zhì)等特點[3]。芽孢桿菌(Bacillus)在畜禽生產(chǎn)中的應用已有很多報道，但是對水產(chǎn)動物生長的影響研究還較少。本試驗通過在飼料中添加枯草芽孢桿菌，分析其對斑點叉尾鮰生長性能和內(nèi)源消化酶活力的影響，為進一步研究枯草芽孢桿菌作為水產(chǎn)飼料添加劑的作用機理提供參考依據(jù)，以便更好地使用微生態(tài)制劑，并為實際生產(chǎn)人工全價飼料及投喂提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚及枯草芽孢桿菌

試驗用魚為斑點叉尾鮰魚種，均重（10.48±0.21）g，購自江蘇省泰興市水產(chǎn)良種場。試驗用枯草芽孢桿菌，活菌量為5.0×109cfu/g，由無錫市大江中盛飼料有限公司提供。

1.2 試驗飼料

按照斑點叉尾鮰魚種營養(yǎng)需求設計飼料配方，自制試驗飼料。在基礎料 (見表1)中分別添加0、100、300、500和700mg/kg枯草芽孢桿菌。將各種原料分別粉碎過60目篩，精確稱量，逐級稀釋、混合，加水攪拌均勻，用小型飼料制粒機制粒，直徑為2.5 mm，自然晾干，放入-20℃冰柜中冷藏備用。

表1 基礎飼料配方及營養(yǎng)水平

1.3 試驗設計與飼養(yǎng)管理

試驗采用單因子完全隨機設計，共5個處理(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組)，分別對應含枯草芽孢桿菌 0、100、300、500和700mg/kg試驗飼料，其中Ⅰ為對照組。每組設置3個重復，每個重復30尾魚。

試驗在鹽城工學院海洋技術循環(huán)流水養(yǎng)殖實驗室進行。用3%的食鹽水溶液對試驗魚消毒后，飼喂基礎飼料馴化14 d，選擇體重10.48 g左右健康的斑點叉尾鮰魚種450尾，隨機分組，放入到水族箱(規(guī)格為100 cm×60 cm×80 cm)中，正式試驗從2009年6月24日至8月12日，共飼養(yǎng)50 d。每天投喂3次，時間為6:30、13:30和18:30，以魚體重的2%～4%投喂。具體投飼量根據(jù)天氣、水質(zhì)及魚的采食情況略微調(diào)整。投飼遵循“四定”原則，每次投喂0.5 h后觀察攝食情況，使其飽食而盡量不剩飼料，如有剩余餌料及時吸出。采用微流水系統(tǒng)養(yǎng)魚，24 h增氧，試驗用水為曝氣后的自來水，平均水溫（25±2）℃，溶解氧大于 5mg/l，氨態(tài)氮低于0.4mg/l，pH值6.8～8.0，早晚各吸污1次，保證水質(zhì)符合漁業(yè)水質(zhì)標準。

1.4 樣品收集和分析方法

1.4.1 取樣及酶液制備

試驗結束時，每箱取3尾魚，隨機取樣。迅速測量體長、稱體重后，置于冰盤內(nèi)解剖，取出胃、腸道、胰臟，用預冷的去離子水(4℃)洗去內(nèi)容物，剔除脂肪、腸系膜，用濾紙吸干后稱重，然后分別加入10倍于相應重量的預冷的0.02 mol/l、pH值7.5磷酸緩沖液，測定胃蛋白酶活力時用pH值4.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，冰浴勻漿，冷凍離心15 min(4 000 r/min)，取上清液即為酶的粗提液，置4℃下保存待用。

1.4.2 斑點叉尾鮰魚種生產(chǎn)性能測定及計算增重率(%)=(平均末重-平均初重)/平均初重×100；蛋白質(zhì)效率比=增重/(攝食量×飼料蛋白質(zhì)含量)。

1.4.3 消化酶測定方法

采用福林-酚試劑法測定蛋白酶活力，蛋白酶活力單位[μg/(g·min)]定義為1 g組織在30℃、pH值7.0的條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量為1個蛋白酶活力單位。采用淀粉酶檢測試劑盒(南京建成)測定淀粉酶活力，淀粉酶活性單位(U)定義為1 g組織在30℃、pH值7.0的條件下，每分鐘水解1mg的淀粉為1個淀粉酶活力單位。采用聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法測定脂肪酶活性，脂肪酶活性單位[μg/(g·min)]定義為 30 ℃、pH 值 7.0的條件下，每分鐘催化產(chǎn)生1 μg分子脂肪酸的酶量為1個酶活力單位。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007初步整理后，用統(tǒng)計分析軟件SAS8.0進行單因素方差分析 (One-Way Anovy)，LSD法進行多重比較，結果用平均值±標準誤（±S.E.）表示。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌對斑點叉尾鮰魚種生產(chǎn)性能的影響（見表2）

表2 枯草芽孢桿菌對斑點叉尾鮰的增重率和蛋白質(zhì)效率比的影響

由表2得知，隨著枯草芽孢桿菌的添加量的增加，斑點叉尾鮰魚種平均末體重、平均增重率、蛋白質(zhì)效率比呈先升高后略微降低的相同變化趨勢。試驗組平均末均重比對照組分別增重了4.23%、8.54%、10.55%、9.18%，除試驗Ⅱ組外，其它試驗組均顯著高于對照組(P＜0.05)；試驗Ⅳ組增重的幅度最大，增重率比對照組顯著提高了46.29%(P＜0.05)；試驗組蛋白質(zhì)效率比分別比對照組提高了14.42%、24.04%、35.58%、27.88%。

2.2 枯草芽孢桿菌對斑點叉尾鮰魚種蛋白酶活力的影響（見表3）

表3 枯草芽孢桿菌對斑點叉尾鮰魚種蛋白酶活力的影響

由表3可知，隨著飼料中枯草芽孢桿菌添加量的增加，斑點叉尾鮰魚種的腸道、胃、胰臟中蛋白酶活力都呈先不同程度的提高后呈著性降低的相似變化趨勢(P＜0.05)。其中，試驗Ⅱ組的腸道、胃、胰臟中蛋白酶活力比對照組有所增加，但差異都不顯著(P＞0.05)，而試驗Ⅲ組的斑點叉尾鮰魚種腸道中的蛋白酶活力比對照組提高了65.39%，試驗Ⅳ組胃、胰臟中蛋白酶活力分別比對照組提高了37.51%、177.68%，差異顯著(P＜0.05)。說明了飼料中添加枯草芽孢桿菌能提高斑點叉尾鮰消化道中蛋白酶活性，且添加量適宜時，腸道和胰臟中的蛋白酶活力提高幅度較大。

2.3 枯草芽孢桿菌對斑點叉尾鮰魚種淀粉酶活力的影響（見表4）

表4 枯草芽孢桿菌對斑點叉尾鮰魚種淀粉酶活力的影響

由表4可知，隨著飼料中枯草芽孢桿菌添加量的增加，斑點叉尾鮰魚種腸道中淀粉酶活力呈先提高后略有下降，再顯著性增加(P＜0.05）的曲線變化趨勢，其中試驗Ⅴ組增加的幅度最大，比對照組提高了30.51%；胰臟中淀粉酶活力略有下降后呈顯著性增加(P＜0.05），試驗組Ⅴ增加的幅度最大，比對照組提高了42.86%。說明了飼料中添加枯草芽孢桿菌能提高斑點叉尾鮰腸道和胰臟中淀粉酶活力，增強對飼料中糖類營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。

2.4 枯草芽孢桿菌對斑點叉尾鮰魚種脂肪酶活力的影響（見表5）

由表5可知，隨著枯草芽孢桿菌添加量的增加，腸道中脂肪酶活力呈先提高后降低的變化趨勢，其中試驗Ⅲ組最高，比對照組增加了61.04%。試驗Ⅳ組胃脂肪酶活力最高，比對照組增加了43.33%，達到顯著性增加(P＜0.05）。試驗Ⅳ組胰臟中脂肪酶活力最高，比對照組增加了48.47%。說明了飼料中添加枯草芽孢桿菌能提高消化道中脂肪酶活力，促進魚類對飼料中脂類物質(zhì)的消化吸收。

3 討論

3.1 枯草芽孢桿菌對斑點叉尾鮰魚種生長性能的影響

付天璽研究發(fā)現(xiàn)，添加1.0×1011和3.0×1011cfu/kg凝結芽孢桿菌飼料組奧尼羅非魚的增重率和蛋白質(zhì)效率較對照組有顯著的提高[4]。華雪銘等研究表明，用0.2%芽孢桿菌能最有效地提高彭澤鯽對飼料蛋白的利用[5]。本試驗結果表明，添加100～700mg/kg枯草芽孢桿菌后飼料中蛋白質(zhì)效率比提高了14.42%～35.58%，促進斑點叉尾魚鮰魚種生長，體重增加4.23%～10.55%，增重率提高24.69%～46.29%，節(jié)約飼料，提高養(yǎng)殖效益。本研究還發(fā)現(xiàn)，并不是添加枯草芽孢桿量越多越好。推測可能原因是在正常情況下，水產(chǎn)動物腸道微生物種群及其數(shù)量處于一個動態(tài)的微生態(tài)平衡，飼料添加芽孢桿菌量過少，不能形成優(yōu)勢種群，即達不到添加的效果；過多，則會破壞這種平衡，導致腸道內(nèi)菌群比例失調(diào)，生產(chǎn)性能下降。

3.2 枯草芽孢桿菌對斑點叉尾鮰魚種消化酶活性的影響

自Sogarrd等[6]報道芽孢桿菌(Bacillus subtilis)具有消化酶活性以來，國內(nèi)在20世紀末開始研究微生態(tài)制劑對水產(chǎn)動物消化酶活性的影響。如丁賢、潘康成、Pan、劉小剛等研究了芽孢桿菌及其它微生態(tài)制劑能提高凡納濱對蝦、鯉魚、銀鯽的消化酶活力[7-10]。本試驗結果表明，在斑點叉尾鮰魚種飼料中添加300～500mg/kg枯草芽孢桿菌能提高消化道中蛋白酶、脂肪酶的活力;添加500～700mg/kg枯草芽孢桿菌能提高消化道中淀粉酶活力。說明飼料中添加適量的枯草芽孢桿菌能夠提高魚類消化酶活力。

目前，有關消化酶活力高低與魚類生長之間的關系尚無定論。伍莉等研究認為，斑點叉尾鮰消化道蛋白酶、淀粉酶的活力大小與魚的生長速度沒有某種線性關系，即消化酶活力越大，生長速度并不一定越快[11]。而丁賢研究表明，對蝦生長與消化酶活力之間存在一定的正向作用關系，即生長速度隨著酶活的增加而增大的關系[7]。本試驗結果認為，飼料中添加枯草芽孢桿菌能提高消化酶活力，顯著提高蛋白質(zhì)效率、特定生長率，促進魚的生長，降低餌料系數(shù)。

分析芽孢桿菌促進魚體生長的原因，一方面是由于微生態(tài)制劑在宿主消化道內(nèi)定植、繁衍、代謝后，可以產(chǎn)生一些消化酶活性物質(zhì)。已有研究表明，動物攝食了添加芽孢桿菌的飼料后，腸道內(nèi)能產(chǎn)生多種酶，如蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、果膠酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶等，補充了內(nèi)源酶的不足，提高了消化道酶的活性，從而促進機體消化系統(tǒng)對營養(yǎng)成分的消化和吸收，提高消化效率[12-13]。但具體是益生菌刺激了腸道消化酶的分泌，還是由于所添加的益生菌本身所產(chǎn)生的胞外酶起作用或是這兩種情況共同作用，還有待進一步探討。另一方面，枯草芽孢桿菌在其生長、繁殖過程中，又能自身合成VC、VB1、VB2和VB6以及氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，為動物提供營養(yǎng)物質(zhì)，促進其生長，提高生產(chǎn)性能[14]。

[1]吳皓,吳盛輝.微生態(tài)制劑及其在魚病防治中的應用 [J].水利漁業(yè),2008,28(1)14-16.

[2]劉燕,王靜慧.微生態(tài)理論和我國動物微生態(tài)制劑研究現(xiàn)狀[J].中國獸藥雜志,2002,36(8):35-38.

[3]Inooka S,Kimura M.The effect of Bacillus natto in feed on the sheep red blood cell antibody response in chickens[J].Avian Dis.,1983,(27):1086-1089.

[4]付天璽,許國煥,吳月嫦,等.凝結芽孢桿菌對奧尼羅非魚消化酶活性、消化率及生長性能的影響 [J].淡水漁業(yè),2008,38(4):30-35.

[5]華雪銘,周洪琪.芽孢桿菌對彭澤鯽飼料蛋白質(zhì)利用的影響[J].飼料研究,2008(1):57-58.

[6]Sogarrd D H,Denmark A S.Microbials for feed beyond lactic acid bacterial[J].Feed Inter.,1990,11(4):32-37.

[7]丁賢,李卓佳,陳永青,等.芽孢桿菌對凡納對蝦生長和消化酶活性的影響[J].中國水產(chǎn)科學,2004,11(6):580-584.

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[9]Pan K C,Yang H B.Progress in study of machanism of Bacillus[J].Feed Industry,1997,28(9):32-34.

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[11]伍莉,陳鵬飛,羅紹祿,等.不同添加劑對斑點叉尾鮰腸道蛋白酶、淀粉酶活力的影響[J].飼料研究,2002(1)：4-7.

[12]劉波,謝駿,劉文斌,等.地衣芽孢桿菌與低聚木糖對異育銀鯽消化酶活性、腸道菌群及生長的影響 [J].大連水產(chǎn)學院學報,2006,21(4):336-340.

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[14]杜衛(wèi)萍.多粘芽孢桿菌分解飼料蛋白和促進魚體生長的研究[D].四川農(nóng)業(yè)大學,2009.