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        氨基酸分析儀測(cè)定魚粉中的氨基酸

        2010-08-09 02:43:22趙志輝
        飼料工業(yè) 2010年22期
        關(guān)鍵詞:魚粉脯氨酸檢出限

        林 淼 趙志輝 雷 萍

        近年來,隨著我國(guó)飼料工業(yè)的迅猛發(fā)展,魚粉的需要量逐年增加,魚粉的質(zhì)量問題越來越引起飼料行業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)的重視。魚粉是水產(chǎn)飼料的主要蛋白源,尤其含有動(dòng)物生長(zhǎng)所必需的氨基酸,含量豐富且配比合理,在飼料、養(yǎng)殖行業(yè)中起著不可代替的作用。由于用量大,價(jià)格高,有些商家在魚粉中摻雜使假、以次充好,使魚粉質(zhì)量參差不齊,給市場(chǎng)造成了一定的混亂[1-2]。摻假、摻雜魚粉中往往是摻入兩種或兩種以上雜質(zhì),并且有些魚粉因加工工藝不當(dāng)造成腐敗,這給魚粉品質(zhì)分析帶來了一定的困難。因此,有必要建立一個(gè)有效的手段對(duì)魚粉中的氨基酸進(jìn)行定量分析。目前,只有少數(shù)幾篇文獻(xiàn)涉及到魚粉的定量分析。對(duì)于氨基酸的分析大多采用液相色譜[3]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[4-5]、毛細(xì)管電泳[6]、凱氏定氮法[7]和光譜法[8-9]等。然而,這些方法或試劑費(fèi)用昂貴,或分離效率低,有些方法還不能同時(shí)測(cè)定多種氨基酸。運(yùn)用氨基酸分析儀可解決上述問題,同時(shí)方法操作簡(jiǎn)便,重現(xiàn)性好,靈敏度高。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 方法原理

        氧化水解法是將魚粉中的氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸等)用過甲酸氧化,然后進(jìn)行酸解,再經(jīng)離子交換色譜分離、測(cè)定[10]。脯氨酸在570 nm處有最大吸收峰,除脯氨酸外,其他各氨基酸均在440 nm有最大吸收峰。因此,在570 nm檢測(cè)波長(zhǎng)計(jì)算脯氨酸含量,而在440 nm檢測(cè)波長(zhǎng)計(jì)算其它各氨基酸含量。

        1.2 試劑與材料

        1.2.1 試劑

        過甲酸溶液:將30%過氧化氫與88%甲酸按1:9(體積比)混合,于室溫下放置1 h,置冰水浴中冷卻30 min(臨用前配制);48%氫溴酸;6.0 mol/l鹽酸溶液:將優(yōu)級(jí)純鹽酸與水按1:1(體積比)混合;茚三酮溶液;流動(dòng)相:參照表1。

        表1 流動(dòng)相梯度洗脫

        除特殊說明,所用試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

        1.2.2 氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

        含天門冬氨酸、蘇氨酸等17種常規(guī)蛋白水解液分析用層析純氨基酸,各組分濃度C(氨基酸)=100 nmol/ml。

        1.3 儀器與設(shè)備

        Aminosys A200自動(dòng)氨基酸分析儀系統(tǒng):配有微型光度檢測(cè)器、超聲波提取器、溶劑微孔過濾器帶0.22 μm水相濾膜、渦旋振蕩器、水浴鍋、真空泵。

        1.4 實(shí)驗(yàn)方法

        1.4.1 試樣制備

        稱取魚粉0.5 g左右(精確至0.000 1 g),置于20 ml濃縮瓶或濃縮管中,于冰水浴中冷卻30 min后加入已經(jīng)冷卻的過甲酸溶液2 ml,加液時(shí)需將樣品全部潤(rùn)濕,但不要搖動(dòng),蓋好瓶塞,放入55℃水浴反應(yīng)15 min,直至全部樣品氧化成淺土黃色;向濃縮管中加入氫溴酸0.3 ml,振搖,使反應(yīng)終止;抽真空;加入約15 ml鹽酸溶液,搖勻,超聲使其溶解,再抽真空,封口,置恒溫箱中,(110±1)℃下水解 22~24 h;取出濃縮管,冷卻,用水將內(nèi)容物定量地轉(zhuǎn)移至50 ml容量瓶中,定容;過0.22 μm濾膜后即可上機(jī)。

        1.4.2 色譜分析

        色譜條件:氨基酸柱(安米諾西斯公司生產(chǎn));柱溫:采用程序升溫,58 ℃(0~38 min)、70 ℃(38~43 min)、75℃(43~75 min)和58℃(75~82 min);流動(dòng)相流速:0.2 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):440 nm/570 nm雙波長(zhǎng)同時(shí)檢測(cè);反應(yīng)器溫度:115℃;分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液及試樣20 μl進(jìn)樣。根據(jù)保留時(shí)間及標(biāo)準(zhǔn)加入法定性,試樣峰面積與標(biāo)準(zhǔn)峰面積比較定量。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 氨基酸的色譜分析

        實(shí)驗(yàn)所測(cè)定17種氨基酸標(biāo)樣色譜圖見圖1。0~64 min圖譜顯示440 nm檢測(cè)結(jié)果,64 min后顯示570 nm檢測(cè)結(jié)果。從圖1可看出,17種氨基酸在選定的分離條件下可以達(dá)到很好的分離效果。

        2.2 精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

        在上述優(yōu)化條件下,將濃度均為100 nmol/ml的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣9次,峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)按出峰次序分別為3.3%(胱氨酸)、4.2%(蛋氨酸)、2.3%(天門冬氨酸)、4.1%(蘇氨酸)、3.7%(絲氨酸)、2.8%(谷氨酸)、2.4%(脯氨酸)、2.4%(甘氨酸)、4.1%(丙氨酸)、3.4%(纈氨酸)、1.9%(異亮氨酸)、2.8%(亮氨酸)、4.3%(酪氨酸)、1.9%(苯丙氨酸)、3.2%(組氨酸)、2.7%(賴氨酸)、2.3%(精氨酸),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在上述優(yōu)化條件下本實(shí)驗(yàn)方法是可行的。

        圖1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)譜圖

        2.3 方法線性方程、檢出限及回收率實(shí)驗(yàn)

        對(duì)氨基酸的混合標(biāo)樣進(jìn)行測(cè)定,得出該方法的檢出限、線性范圍,所得的數(shù)據(jù)見表2。由表2可知,該方法對(duì)17種氨基酸的檢測(cè)具有較低的檢出限、較寬的線性范圍和較高的回收率,較高的回收率也說明了用該方法檢測(cè)魚粉中的氨基酸所得到的數(shù)據(jù)是準(zhǔn)確可靠的。

        表2 17種氨基酸的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及回收率

        圖2 國(guó)產(chǎn)魚粉中氨基酸標(biāo)準(zhǔn)譜圖

        3 魚粉中氨基酸的測(cè)定

        用所建立的方法檢測(cè)了4家國(guó)內(nèi)不同廠家魚粉及2家進(jìn)口魚粉,國(guó)內(nèi)魚粉和進(jìn)口魚粉各選擇一個(gè)有代表性的典型樣品圖譜見圖2、圖3,6家樣品的分析結(jié)果見表3(其中樣品1~4為4家國(guó)內(nèi)不同廠家魚粉,樣品5~6為進(jìn)口魚粉)。

        4 結(jié)論

        當(dāng)前飼料企業(yè)步履維艱,如果不控制好原料的質(zhì)量,特別是昂貴的動(dòng)物性蛋白飼料——魚粉,后果將是嚴(yán)重的。魚粉是飼料工業(yè)的重要原料,其水解液中氨基酸的測(cè)定對(duì)其營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)和飼料配制具有重要意義,所以使用魚粉的飼料企業(yè)只有嚴(yán)把質(zhì)量關(guān),才能控制成品的質(zhì)量,并使養(yǎng)殖戶用上優(yōu)質(zhì)的飼料。文中使用氨基酸分析儀測(cè)定魚粉中的氨基酸的方法,快速、簡(jiǎn)便和靈敏,所得圖譜為魚粉的質(zhì)量控制提供了直觀、可靠的科學(xué)佐證。

        圖3 進(jìn)口魚粉中氨基酸標(biāo)準(zhǔn)譜圖

        表3 魚粉中氨基酸的分析結(jié)果(n=3)(%)

        [1]魏紅,鐘紅艦.魚粉的品質(zhì)和摻偽情況判定[J].飼料與添加劑,2004(2):47-48.

        [2]田培育,柏風(fēng)琴,劉麗秋,等.國(guó)產(chǎn)魚粉質(zhì)量實(shí)測(cè)結(jié)果分析[J].草原與飼料,1994(2):11-12.

        [3]劉利娥,常愛武,韓萍,等.反相高效液相色譜法測(cè)定野生四葉參中氨基酸[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2008,43(1):101-103.

        [4]張紅漫,于文濤,歐陽平凱,等.氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定中藥沙苑子中的氨基酸[J].氨基酸和生物資源,2004,26(2):62-64.

        [5]Jorgen Persson,Torgny Nasholm.A GC-MS method for determination of amino acid uptake by plants[J].Physiol Plant.,2001,113:352-358.

        [6]Zian Lin,Zenghong Xie.Direct determination of amino acids by pressurized capillary electrochromatography with chemiluminescence detection[J].Electrodriven Separation,2008,31:2852-2859.

        [7]羅欽,陳人弼,宋永康.魚粉中寡肽和游離氨基酸的測(cè)定方法[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2005 ,20(4):285-288.

        [8]丁麗敏,計(jì)成,陳怡煌,等.近紅外光譜分析技術(shù)快速測(cè)定魚粉氨基酸含量的研究[J].飼料研究,1999(5):24-26.

        [9]K K Verma,A Jain,J.Gasparic.Spectrophotometric determination of tryptophan by reaction with nitrous acid[J].Talanta,1988,35:35-39.

        [10]GB18246-2000,飼料中氨基酸的測(cè)定[S].

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