林 淼 趙志輝 雷 萍

近年來，隨著我國(guó)飼料工業(yè)的迅猛發(fā)展，魚粉的需要量逐年增加，魚粉的質(zhì)量問題越來越引起飼料行業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)的重視。魚粉是水產(chǎn)飼料的主要蛋白源，尤其含有動(dòng)物生長(zhǎng)所必需的氨基酸，含量豐富且配比合理，在飼料、養(yǎng)殖行業(yè)中起著不可代替的作用。由于用量大，價(jià)格高，有些商家在魚粉中摻雜使假、以次充好，使魚粉質(zhì)量參差不齊，給市場(chǎng)造成了一定的混亂[1-2]。摻假、摻雜魚粉中往往是摻入兩種或兩種以上雜質(zhì)，并且有些魚粉因加工工藝不當(dāng)造成腐敗，這給魚粉品質(zhì)分析帶來了一定的困難。因此，有必要建立一個(gè)有效的手段對(duì)魚粉中的氨基酸進(jìn)行定量分析。目前，只有少數(shù)幾篇文獻(xiàn)涉及到魚粉的定量分析。對(duì)于氨基酸的分析大多采用液相色譜[3]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[4-5]、毛細(xì)管電泳[6]、凱氏定氮法[7]和光譜法[8-9]等。然而，這些方法或試劑費(fèi)用昂貴，或分離效率低，有些方法還不能同時(shí)測(cè)定多種氨基酸。運(yùn)用氨基酸分析儀可解決上述問題，同時(shí)方法操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，靈敏度高。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 方法原理

氧化水解法是將魚粉中的氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸等)用過甲酸氧化，然后進(jìn)行酸解，再經(jīng)離子交換色譜分離、測(cè)定[10]。脯氨酸在570 nm處有最大吸收峰，除脯氨酸外，其他各氨基酸均在440 nm有最大吸收峰。因此，在570 nm檢測(cè)波長(zhǎng)計(jì)算脯氨酸含量，而在440 nm檢測(cè)波長(zhǎng)計(jì)算其它各氨基酸含量。

1.2 試劑與材料

1.2.1 試劑

過甲酸溶液：將30%過氧化氫與88%甲酸按1：9(體積比)混合，于室溫下放置1 h，置冰水浴中冷卻30 min(臨用前配制)；48%氫溴酸；6.0 mol/l鹽酸溶液：將優(yōu)級(jí)純鹽酸與水按1：1(體積比)混合；茚三酮溶液；流動(dòng)相：參照表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫

除特殊說明，所用試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2.2 氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

含天門冬氨酸、蘇氨酸等17種常規(guī)蛋白水解液分析用層析純氨基酸，各組分濃度C(氨基酸)=100 nmol/ml。

1.3 儀器與設(shè)備

Aminosys A200自動(dòng)氨基酸分析儀系統(tǒng)：配有微型光度檢測(cè)器、超聲波提取器、溶劑微孔過濾器帶0.22 μm水相濾膜、渦旋振蕩器、水浴鍋、真空泵。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 試樣制備

稱取魚粉0.5 g左右(精確至0.000 1 g)，置于20 ml濃縮瓶或濃縮管中，于冰水浴中冷卻30 min后加入已經(jīng)冷卻的過甲酸溶液2 ml，加液時(shí)需將樣品全部潤(rùn)濕，但不要搖動(dòng)，蓋好瓶塞，放入55℃水浴反應(yīng)15 min，直至全部樣品氧化成淺土黃色；向濃縮管中加入氫溴酸0.3 ml，振搖，使反應(yīng)終止；抽真空；加入約15 ml鹽酸溶液，搖勻，超聲使其溶解，再抽真空，封口，置恒溫箱中，（110±1）℃下水解 22～24 h；取出濃縮管，冷卻，用水將內(nèi)容物定量地轉(zhuǎn)移至50 ml容量瓶中，定容；過0.22 μm濾膜后即可上機(jī)。

1.4.2 色譜分析

色譜條件：氨基酸柱(安米諾西斯公司生產(chǎn))；柱溫：采用程序升溫，58 ℃(0～38 min)、70 ℃(38～43 min)、75℃(43～75 min)和58℃(75～82 min)；流動(dòng)相流速：0.2 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：440 nm/570 nm雙波長(zhǎng)同時(shí)檢測(cè)；反應(yīng)器溫度：115℃；分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液及試樣20 μl進(jìn)樣。根據(jù)保留時(shí)間及標(biāo)準(zhǔn)加入法定性，試樣峰面積與標(biāo)準(zhǔn)峰面積比較定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 氨基酸的色譜分析

實(shí)驗(yàn)所測(cè)定17種氨基酸標(biāo)樣色譜圖見圖1。0～64 min圖譜顯示440 nm檢測(cè)結(jié)果，64 min后顯示570 nm檢測(cè)結(jié)果。從圖1可看出，17種氨基酸在選定的分離條件下可以達(dá)到很好的分離效果。

2.2 精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

在上述優(yōu)化條件下，將濃度均為100 nmol/ml的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣9次，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)按出峰次序分別為3.3%(胱氨酸)、4.2%(蛋氨酸)、2.3%(天門冬氨酸)、4.1%(蘇氨酸)、3.7%(絲氨酸)、2.8%(谷氨酸)、2.4%(脯氨酸)、2.4%(甘氨酸)、4.1%(丙氨酸)、3.4%(纈氨酸)、1.9%(異亮氨酸)、2.8%(亮氨酸)、4.3%(酪氨酸)、1.9%(苯丙氨酸)、3.2%(組氨酸)、2.7%(賴氨酸)、2.3%(精氨酸)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在上述優(yōu)化條件下本實(shí)驗(yàn)方法是可行的。

圖1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)譜圖

2.3 方法線性方程、檢出限及回收率實(shí)驗(yàn)

對(duì)氨基酸的混合標(biāo)樣進(jìn)行測(cè)定，得出該方法的檢出限、線性范圍，所得的數(shù)據(jù)見表2。由表2可知，該方法對(duì)17種氨基酸的檢測(cè)具有較低的檢出限、較寬的線性范圍和較高的回收率，較高的回收率也說明了用該方法檢測(cè)魚粉中的氨基酸所得到的數(shù)據(jù)是準(zhǔn)確可靠的。

表2 17種氨基酸的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及回收率

圖2 國(guó)產(chǎn)魚粉中氨基酸標(biāo)準(zhǔn)譜圖

3 魚粉中氨基酸的測(cè)定

用所建立的方法檢測(cè)了4家國(guó)內(nèi)不同廠家魚粉及2家進(jìn)口魚粉，國(guó)內(nèi)魚粉和進(jìn)口魚粉各選擇一個(gè)有代表性的典型樣品圖譜見圖2、圖3，6家樣品的分析結(jié)果見表3(其中樣品1～4為4家國(guó)內(nèi)不同廠家魚粉，樣品5～6為進(jìn)口魚粉)。

4 結(jié)論

當(dāng)前飼料企業(yè)步履維艱，如果不控制好原料的質(zhì)量，特別是昂貴的動(dòng)物性蛋白飼料——魚粉，后果將是嚴(yán)重的。魚粉是飼料工業(yè)的重要原料，其水解液中氨基酸的測(cè)定對(duì)其營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)和飼料配制具有重要意義，所以使用魚粉的飼料企業(yè)只有嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)，才能控制成品的質(zhì)量，并使養(yǎng)殖戶用上優(yōu)質(zhì)的飼料。文中使用氨基酸分析儀測(cè)定魚粉中的氨基酸的方法，快速、簡(jiǎn)便和靈敏，所得圖譜為魚粉的質(zhì)量控制提供了直觀、可靠的科學(xué)佐證。

圖3 進(jìn)口魚粉中氨基酸標(biāo)準(zhǔn)譜圖

表3 魚粉中氨基酸的分析結(jié)果(n=3)（%）

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