付小猛 趙述淼 梁運(yùn)祥 葛向陽(yáng)

因抗生素的濫用而導(dǎo)致的毒性殘留、耐藥性等問(wèn)題已引起人們的廣泛關(guān)注。尋找安全、無(wú)毒的替代品迫在眉睫。作為抗生素的替代品之一，芽孢桿菌制劑能抑制腸道腐敗菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)動(dòng)物生產(chǎn)，并且能形成芽孢，可以耐受高溫和具有良好的貯存性能，一直都是畜牧業(yè)科研和生產(chǎn)人員關(guān)注的焦點(diǎn)[1]。

芽孢的形成受環(huán)境因素的影響，不同菌種形成芽孢的條件不同。枯草芽孢桿菌的芽孢較其它營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞易保存，存活率高，是制備枯草芽孢桿菌制劑的理想存在形式，而制劑中的芽孢含量是影響產(chǎn)品應(yīng)用效果的關(guān)鍵因素[2]。目前,芽孢桿菌制劑的生產(chǎn)方式有兩種：液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵。液態(tài)發(fā)酵易實(shí)現(xiàn)純培養(yǎng)和工業(yè)化生產(chǎn)，但對(duì)設(shè)備要求高，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，且環(huán)境污染嚴(yán)重；而固體發(fā)酵采用的原料一般是廉價(jià)的農(nóng)副產(chǎn)品(如麩皮、谷殼等)，采用的設(shè)備也較液體發(fā)酵簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本大大低于液體發(fā)酵。因此，選取合適的生產(chǎn)方式，實(shí)現(xiàn)低成本、高產(chǎn)率，滿足畜牧業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的需要，是一個(gè)亟待解決的課題[3]。本課題的研究目的就是通過(guò)對(duì)枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵工藝的優(yōu)化，以期獲得較佳產(chǎn)孢條件，為飼用枯草芽孢桿菌制劑的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CCAM 080032，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

液體種子培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基；平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基；固體發(fā)酵培養(yǎng)基原料及試劑：麩皮、稻草粉、葡萄糖、胰蛋白胨、NH4NO3、KH2PO4等。

1.3 種子液的制備

從活化好的枯草芽孢桿菌試管斜面接一環(huán)菌種至液體種子培養(yǎng)基，置37℃、200 r/min控溫?fù)u床下培養(yǎng)17 h。

1.4 固態(tài)培養(yǎng)

根據(jù)試驗(yàn)配方稱取固體發(fā)酵培養(yǎng)基原料，裝料量為40 g，加入適當(dāng)蒸餾水，121℃高壓滅菌30 min，冷卻至室溫后，以接種量為5%接入種子液，在37℃培養(yǎng)48 h，然后60℃烘干、粉碎、計(jì)芽孢數(shù)。

1.5 芽孢計(jì)數(shù)方法

按平板菌落計(jì)數(shù)法[4]計(jì)算芽孢數(shù)：準(zhǔn)確稱取粉碎后發(fā)酵物料10 g，放入盛有90 ml無(wú)菌生理鹽水的三角瓶中制成菌懸液，80℃水浴15 min殺死營(yíng)養(yǎng)體，然后將菌懸液稀釋至10-7～10-8，取100 μl均勻涂布到LB平板上，于37℃倒置培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.6 培養(yǎng)基優(yōu)化

1.6.1 培養(yǎng)基固體基質(zhì)的選擇

用膨潤(rùn)土、玉米芯粉、稻草粉、谷殼、豆粕分別與麩皮以 1： 3（w/w）混合，料水比為 1： 1.5，按初始條件進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束測(cè)定芽孢產(chǎn)量，確定最適的基質(zhì)成分。確定基本組成后，再按比例配制基質(zhì)，確定兩種基質(zhì)的最佳配比。

1.6.2 外加碳源優(yōu)化

分別按50 g/kg的濃度添加葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉到培養(yǎng)基中。其他條件保持一致，37℃發(fā)酵48 h后測(cè)定芽孢產(chǎn)量。確定最適外加碳源的種類。

1.6.3 外加氮源優(yōu)化

按表1所示比例分別添加硝酸鈉、硝酸銨、氯化銨、硫酸銨、尿素、胰蛋白胨、酵母抽提物到含50 g/kg葡萄糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。其他條件保持一致，37℃發(fā)酵48 h后測(cè)定芽孢產(chǎn)量，確定最適外加氮源的種類。

表1 外加氮源對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響

1.6.4 培養(yǎng)基的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

依據(jù)之前的試驗(yàn)結(jié)果，且根據(jù)磷酸鹽是細(xì)菌細(xì)胞壁合成必需的營(yíng)養(yǎng)元素，在固體發(fā)酵中可以促進(jìn)菌體生物量的增加[5]，選擇葡萄糖、胰蛋白胨、硝酸銨以及磷酸二氫鉀四個(gè)因素，采用正交設(shè)計(jì)表L9（34），以確定最佳培養(yǎng)基配方。

1.7 培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.7.1 發(fā)酵時(shí)間的確定

將枯草芽孢桿菌CCAM 080032在37℃下進(jìn)行固態(tài)培養(yǎng)，每12 h取樣測(cè)定芽孢產(chǎn)量，以確定最適的發(fā)酵時(shí)間。

1.7.2 發(fā)酵溫度的選擇

分別在 30、34、37、40、45 ℃的溫度下，發(fā)酵 48 h后測(cè)定芽孢產(chǎn)量，確定最適的發(fā)酵溫度。

1.7.3 料水比的確定

通過(guò)控制添加的蒸餾水的量，使培養(yǎng)基料水比分別為 1： 1、1： 1.25、1： 1.5、1： 1.75，其他條件保持一致，37℃發(fā)酵48 h后測(cè)定芽孢產(chǎn)量，以確定最佳的初始料水比。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 培養(yǎng)基固體基質(zhì)的選擇

在固體發(fā)酵中，基質(zhì)的選擇非常關(guān)鍵。基質(zhì)不僅能為菌體的生長(zhǎng)提供必需的底物，還可以影響微生物發(fā)酵過(guò)程的傳質(zhì)、傳熱及微生物的代謝功能等。不同的基質(zhì)，由于其疏松程度不一樣，氧和熱量的傳遞效率也不一樣。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵基質(zhì)一般為透氣性較好、營(yíng)養(yǎng)豐富的麩皮。在發(fā)酵過(guò)程中，為了增加培養(yǎng)基的透氣性，可以添加適量的其他基質(zhì)。在供試的5種固體基質(zhì)中，稻草粉可以顯著提高芽孢產(chǎn)量，芽孢產(chǎn)量達(dá)到5.67×1010CFU/g干物料（見(jiàn)圖1）。

圖1 不同固體基質(zhì)對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響

確定麩皮和稻草粉為固體發(fā)酵的基質(zhì)后，進(jìn)一步優(yōu)化其配比。結(jié)果表明（見(jiàn)圖2），稻草粉的含量過(guò)高或過(guò)低都不利于芽孢產(chǎn)量的提高，稻草粉和麩皮的最適比例應(yīng)控制在2：8。此時(shí)，芽孢產(chǎn)量達(dá)到5.90×1010CFU/g干物料。

2.1.2 外加碳源優(yōu)化

分別按50 g/kg的濃度添加葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉到培養(yǎng)基中。其他條件保持一致進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果如圖3所示，以葡萄糖為外加碳源時(shí)枯草芽孢桿菌的芽孢產(chǎn)量明顯高于蔗糖、麥芽糖和可溶性淀粉，最高可達(dá)到6.23×1010CFU/g干物料。說(shuō)明該枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的最適碳源為葡萄糖。

圖2 麩皮與稻草最佳比例的確定

圖3 外加碳源對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響

2.1.3 外加氮源優(yōu)化

按表1所示比例分別添加 NaNO3、NH4NO3、NH4Cl、(NH4)2SO4、(NH2)2CO、胰蛋白胨、酵母抽提物到含50 g/kg葡萄糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。其他條件保持一致進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果如表1所示，以NH4NO3和胰蛋白胨為外加氮源時(shí)該枯草芽孢桿菌的芽孢產(chǎn)量有所提高，分別達(dá)到 6.53×1010CFU/g 和 6.93×1010CFU/g，這說(shuō)明此菌既能利用有機(jī)氮源也能利用無(wú)機(jī)氮源，因此，以NH4NO3和胰蛋白胨組成的復(fù)合氮源為其最適的外加氮源。

2.1.4 培養(yǎng)基的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

依據(jù)之前的試驗(yàn)結(jié)果，選擇葡萄糖、胰蛋白胨、NH4NO3以及KH2PO4四個(gè)因素，采用正交設(shè)計(jì)表L9（34），以確定最佳培養(yǎng)基配方。從極差分析結(jié)果可以看出，影響芽孢產(chǎn)量的主要因素排序?yàn)椋阂鹊鞍纂耍綨H4NO3＞葡萄糖＞KH2PO4。從正交試驗(yàn)得到外加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)最適的組分含量為葡萄糖50 g/kg、胰蛋白胨20 g/kg、NH4NO315 g/kg、KH2PO410 g/kg。采用最優(yōu)的一組培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，芽孢產(chǎn)量可達(dá)到7.26×1010CFU/g。

表2 正交試驗(yàn)L9（34）測(cè)試結(jié)果

2.2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵時(shí)間的確定

發(fā)酵周期也是一個(gè)很重要的試驗(yàn)指標(biāo)，因?yàn)榭s短發(fā)酵周期就意味著降低能耗，節(jié)約生產(chǎn)成本，增加生產(chǎn)批次[6]，將枯草芽孢桿菌在37℃下進(jìn)行固態(tài)培養(yǎng)，每12 h取樣測(cè)定芽孢產(chǎn)量。結(jié)果如圖4所示，菌株在培養(yǎng)12～48 h內(nèi)，芽孢產(chǎn)量呈明顯上升趨勢(shì)，48 h時(shí)達(dá)最大值，然后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)(48～60 h)，芽孢產(chǎn)量不再增加甚至下降，而且，在生產(chǎn)實(shí)踐中隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)能源的消耗和污染雜菌的機(jī)會(huì)都會(huì)增加，因此，最適的發(fā)酵時(shí)間為48 h，此時(shí)芽孢產(chǎn)量最高，為 6.67×1010CFU/g干物料。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響

2.2.2 發(fā)酵溫度的選擇

在 30、34、37、40、45 ℃的發(fā)酵溫度下，發(fā)酵 48 h后測(cè)定芽孢產(chǎn)量，結(jié)果如圖5所示，溫度過(guò)高時(shí)培養(yǎng)基水分迅速喪失，而溫度過(guò)低導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)緩慢，在37℃時(shí)芽孢產(chǎn)量達(dá)到最大，為6.95×1010CFU/g。因此，該菌株最適生長(zhǎng)溫度為37℃。

圖5 溫度對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響

2.2.3 料水比的確定

固態(tài)發(fā)酵最大的特點(diǎn)就是無(wú)游離水，因而底物含水量的變化，對(duì)微生物的生長(zhǎng)及代謝能力會(huì)產(chǎn)生重要的影響[7]。適宜的初始含水量，有助于菌體吸收培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧的傳遞，從而促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)繁殖。結(jié)果如圖6所示，水分過(guò)高或過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致芽孢產(chǎn)量的下降，而最適的料水比為1：1.5，此時(shí)芽孢產(chǎn)量達(dá)到 7.9×1010CFU/g。

圖6 料水比對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響

3 討論

研究結(jié)果表明，固體培養(yǎng)基的成分和發(fā)酵條件（如發(fā)酵時(shí)間、溫度及料水比等）都是影響芽孢形成和生物量的重要因素。通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)方法，確定了枯草芽孢桿菌CCAM 080032的最優(yōu)培養(yǎng)基為：稻草粉：麩皮2：8、葡萄糖50 g、胰蛋白胨20g、NH4NO315g、KH2PO410g、H2O1500g，在 37 ℃培養(yǎng) 48 h后，芽孢產(chǎn)量可達(dá)到7.90×1010CFU/g。

近年來(lái)，枯草芽孢桿菌作為飼料微生態(tài)制劑在畜禽養(yǎng)殖中受到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，而通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件提高其芽孢產(chǎn)量是降低生產(chǎn)成本的重要手段。張志焱等[8]通過(guò)優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵工藝，最終使枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)達(dá)到460億個(gè)/g；而Chen等[9]、郭小華等[10]通過(guò)液態(tài)深層發(fā)酵獲得的芽孢產(chǎn)量分別為1.52×1010CFU/ml和3.10×109CFU/ml。與前人的研究結(jié)果相比，本研究所采用的固態(tài)發(fā)酵工藝的生產(chǎn)成本更低、產(chǎn)量更高，具有較大的優(yōu)勢(shì)。

與固態(tài)發(fā)酵相比，液態(tài)發(fā)酵從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模到工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵放大以及限制因素的檢測(cè)和控制相對(duì)容易，而固態(tài)發(fā)酵在傳質(zhì)、傳熱方面還缺乏全面的、詳細(xì)的研究[11]。因此，固態(tài)發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)室小試和工業(yè)化生產(chǎn)之間的條件控制有很大的差異，如何改進(jìn)生產(chǎn)中的發(fā)酵設(shè)備及發(fā)酵條件，使之實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)是下一步迫切需要解決的問(wèn)題。

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