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        使用優(yōu)化PAGE電泳及銀染技術(shù)檢測臨床糞便樣品中的輪狀病毒RNA

        2010-08-09 00:57:28楊昭慶黃永坤劉馨
        中國醫(yī)藥生物技術(shù) 2010年4期
        關(guān)鍵詞:輪狀病毒丙烯酰胺電泳

        楊昭慶,黃永坤,劉馨

        人輪狀病毒腸炎是世界范圍內(nèi)的一個(gè)重要的健康問題,也是引起兒童腹瀉并導(dǎo)致死亡的主要原因之一[1]??焖儆行У胤蛛x、鑒定臨床糞便樣中的輪狀病毒,不僅可以確證輪狀病毒的感染,還可以準(zhǔn)確監(jiān)控輪狀病毒流行株的變化,積累輪狀病毒的流行病學(xué)數(shù)據(jù)。輪狀病毒的基因組為雙鏈RNA,分為 11 個(gè)節(jié)段,不同株型輪狀病毒的 RNA 電泳圖譜存在差異,可由此初步判定輪狀病毒株型別[2]。本文以猴輪狀病毒 SA11 株的 RNA 基因組作為模版,對 PAGE電泳和銀染的檢測條件進(jìn)行優(yōu)化,并使用優(yōu)化后的條件對臨床糞便樣品進(jìn)行檢測。

        1 材料與方法

        1.1 主要材料和儀器

        猴輪狀病毒 SA11 株為本所保存;12 份臨床樣品來自云南昆明醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院,為兒科急性腹瀉小兒糞便樣本,收集的時(shí)間為 2009 年 11 月,隨機(jī)編號 1~12 號;A 群輪狀病毒膠體金診斷試紙購自北京萬泰生物藥業(yè)有限公司;小量液體樣品 RNA 抽提試劑盒購自上海華舜生物技術(shù)有限公司;小型垂直電泳槽購自 Bio-Rad 公司。

        1.2 方法

        在不改變電泳設(shè)備的前提下,以猴輪狀病毒 SA11 株為模版,對其 RAN 基因組的電泳條件進(jìn)行了比較和優(yōu)化,包括不同丙烯酰胺和N,N’-甲叉丙烯酰胺配比、分離膠、積層膠濃度、電壓、電泳時(shí)間,銀染的染色和顯色時(shí)間。并以優(yōu)化后條件對細(xì)胞培養(yǎng)的不同代次的輪狀病毒 RNA 基因組進(jìn)行檢測和重復(fù)實(shí)驗(yàn),確定其穩(wěn)定性。

        PAGE 電泳的緩沖液為 TBE,電泳結(jié)束后,使用 10%無水乙醇和0.5% 的冰乙酸洗滌凝膠 2 次,每次 5 min,然后使用 0.2% 的硝酸銀溶液染色,顯色液為 NaOH 和甲醛溶液。

        使用 A 群輪狀病毒膠體金診斷試紙對腹瀉樣品進(jìn)行快速檢測(具體方法參照該產(chǎn)品說明書),將陽性樣品用20 mmol,pH 7.4 的 PBS 制成 10% 懸液,于 3724 × g 條件下,離心 30 min。上清用 0.2 μm 濾膜過濾后,取 250 μl濾液用 RNA 抽提試劑盒提取病毒 RNA,取 10 μl RNA 抽提物,然后進(jìn)行 PAGE 電泳和銀染檢測。

        2 結(jié)果

        對 PAGE 電泳的條件優(yōu)化如下:采用的聚丙烯酰胺凝膠選用了不同的丙烯酰胺和N,N’-甲叉丙烯酰胺配比,分別為 37.5∶1、29∶1、20∶1 和7.25∶1,分離膠濃度從 5%~20%,電泳時(shí)間從 3~15 h,電壓從 60~120 V(表 1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),采用丙烯酰胺和N,N’-甲叉丙烯酰胺配比為29∶1 的凝膠,3.5% 基層膠,10% 分離膠,以 60 V 電泳6 h,輪狀病毒 RNA 基因組的 11 個(gè)節(jié)段可獲得較好的分離。其次我們對銀染的條件進(jìn)行了優(yōu)化,比較了染色時(shí)間和顯色時(shí)間的長短對同一樣品染色效果的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),使用新鮮配制的硝酸銀溶液,染色 2 min 即可,延長時(shí)間對實(shí)驗(yàn)的結(jié)果沒有影響,顯色時(shí)間控制在 5 min 以內(nèi),可以有效地降低背景染色,提高對比度。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,該方法用于檢測體外培養(yǎng)的不同代次的輪狀病毒 RNA 基因組,結(jié)果穩(wěn)定[3]。

        表1 不同凝膠濃度、電泳時(shí)間及電壓對分離效果的影響

        利用上述條件對臨床糞便樣品中的輪狀病毒 RNA 基因組進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),1 號和4 號樣品的 RNA 濃度較低,但是仍能看到輪狀病毒的特異基因組帶型,1 號和6 號的電泳背景較深,可能與糞便樣品的成分有關(guān),5 號樣品的帶型與 Wa 株相似,6 號和7 號的型別還有待于進(jìn)一步的鑒定。

        用 A 群輪狀病毒膠體金試紙檢測發(fā)現(xiàn),12 份糞便樣品中有 5份樣品為抗原陽性,分別為 1、4、5、6、7 號樣品。我們采用上述優(yōu)化后的方法,對這 5 個(gè)樣品抽提的RNA 進(jìn)行檢測(圖 1)。

        圖1 臨床糞便樣品 1、4、5、6、7 號中輪狀病毒 RNA 基因組的電泳圖譜

        3 討論

        輪狀病毒的雙鏈 RNA 基因組在凝膠電泳時(shí)分為 11個(gè)節(jié)段,7、8、9 三個(gè)條帶的分子量較為相近:第 7 條 RNA與第 8 條 RNA 的大小相差 45 bp;而第 8 條 RNA 與第9 條 RNA 僅相差 3 bp,使用本文所述電泳設(shè)備,其制膠長度為 5 cm,這 3 個(gè)條帶沒有得到有效地分離,選用較長的凝膠可以解決這個(gè)問題,但是因?yàn)檫@ 3 條帶的電泳圖譜在輪狀病毒株型之間差異不明顯[4],因此目前的結(jié)果已經(jīng)滿足實(shí)驗(yàn)樣品的檢測需要。

        聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染的方法(PAGE-SS)作為檢測輪狀病毒 RNA 基因組的方法被廣泛使用[5],但是實(shí)驗(yàn)設(shè)備、實(shí)驗(yàn)條件的差異影響電泳結(jié)果,使得實(shí)驗(yàn)不僅耗時(shí)長,而且結(jié)果不具有可比性。我們在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,比較了凝膠濃度、電泳時(shí)間、電壓、銀染的染色和顯色時(shí)間等參數(shù)對 PAGE 結(jié)果的影響,優(yōu)化得到了一個(gè)穩(wěn)定快速的輪狀病毒 RNA 基因組 PAGE-SS 檢測方法。

        [1]Madhi SA, Cunliffe NA, Steele D, et al.Effect of human rotavirus vaccine on severe diarrhea in African infants.N Engl J Med, 2010,362(4):289-298.

        [2]Herring AJ, Inglis NF, Ojeh CK, et al.Rapid diagnosis of rotavirus infection by direct detection of viral nucleic acid in silver-stained polyacrylamide gels.J Clin Microbiol, 1982, 16(3):473-477.

        [3]Zhang GM, Zhang YX, Liu X, et al.Adaptability of rotavirus P[2]G3 strain in Vero cells.Chin J Biologicals, 2008, 21(12):1078-1079.(in Chinese)張光明, 張永欣, 劉馨, 等.輪狀病毒P[2]G3株在Vero細(xì)胞上的傳代適應(yīng)性.中國生物制品學(xué)雜志, 2008, 21(12):1078-1079.

        [4]Estes MK, Cohen J.Rotavirus gene structure and function.Microbiol Rev, 1989, 53(4):410-449.

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