楊傳旭，葛志強

藥物的靶向給藥已成為近年來藥物輸送系統(tǒng)領(lǐng)域研究的熱點。藥物的靶向可分為被動靶向和主動靶向，被動靶向是指依靠藥物自身的設(shè)計或所制備的藥物載體的粒徑、形狀等因素減少與非靶細胞、組織及器官的非特異性相互作用來增加靶部位/非靶部位的藥物水平比率。而主動靶向是指利用抗原-抗體結(jié)合或配體-配基結(jié)合等生物特異性相互作用來實現(xiàn)藥物的靶向傳遞，目前可作為主動靶向的配體或“靶向載體”的主要是抗體、多肽、葉酸、多糖。而近幾年國外以核酸適體（aptamer）（包括 DNA 或 RNA）作藥物主動靶向給藥載體的研究日益受到研究人員的關(guān)注，已成為主動靶向給藥系統(tǒng)研究領(lǐng)域的新課題。核酸適體是一段寡聚的單鏈 DNA 或 RNA，一般由 20～80 個堿基構(gòu)成，分子量介于 6～25 kD，能折疊成特殊的三維結(jié)構(gòu)，特異性地識別并結(jié)合蛋白質(zhì)、糖類、核苷酸等分子[1]。大量研究結(jié)果表明，通過設(shè)計核酸適體與藥物的結(jié)合體，能夠?qū)崿F(xiàn)藥物或藥物載體的靶向傳遞，提高藥物療效并減輕不良反應(yīng)，為主動靶向給藥系統(tǒng)的開發(fā)提供了新的方向。本文就以適體作為藥物靶向載體的研究進展做一簡要綜述。

1 核酸適體作為“靶向載體”的優(yōu)勢

選擇一種具有高特異性與親和性的“靶向載體”一直是制約主動靶向給藥系統(tǒng)研究的瓶頸。雖然抗體、多肽和葉酸等分子已有作為藥物靶向載體研究成功的報道，但這些化合物應(yīng)用均存在著目前難以克服的缺陷。例如，單克隆抗體由于潛在的免疫原性（immunogenicity）和制備的困難大大限制了其臨床的應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化的進程[2]；葉酸等雖然易于制備，但要求病變組織細胞具有足夠多的葉酸受體，而且由于正常組織細胞也存在葉酸受體，導(dǎo)致其靶向作用并不理想[3-4]，而核酸適體卻具有以下優(yōu)點：

⑴核酸適體與靶細胞結(jié)合的特異性和單克隆受體相似，甚至更高。核酸適體識別并結(jié)合靶點的機制在于其折疊為特定三維結(jié)構(gòu)，暴露出活性位點與受體發(fā)生特異性作用。特別是通過近期發(fā)展起來的全細胞配體系統(tǒng)進化的指數(shù)富集（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選技術(shù)[5]、細胞表面靶點 SELEX 技術(shù)[6]和單株SELEX 篩選技術(shù)[7]得到的適體對受體具有高度的特異結(jié)合能力。

⑵核酸適體沒有明顯的免疫原性[8]。適體介導(dǎo)的靶向藥物注入人體內(nèi)不會引發(fā)免疫反應(yīng)，因此，在醫(yī)藥應(yīng)用領(lǐng)域比單克隆抗體更加安全可靠。

⑶核酸適體分子體積較小，比單克隆抗體更易穿透組織和器官。同時，當核酸適體連接到藥物載體表面時，系統(tǒng)的體積不會有很大地增加，使藥物載體體積更容易控制。

⑷核酸適體容易進行各種化學(xué)修飾擴展其應(yīng)用范圍，例如通過放射性標記、熒光素、生物素的修飾用于監(jiān)測和識別腫瘤細胞[9]。

⑸核酸適體的制備方便，且比單克隆抗體有更高的穩(wěn)定性，可以在許多緩沖溶液中保存，所以在生產(chǎn)、儲存和運輸當中有很大的優(yōu)勢[10]。

⑹核酸適體結(jié)構(gòu)的多樣性導(dǎo)致其具有廣泛的受體范圍，從小分子到蛋白質(zhì)，甚至到細胞[11-13]。正由于其受體廣泛的特性，適體可以作為多種疾病的尋靶“引導(dǎo)子”。

2 核酸適體在靶向制劑中的應(yīng)用

2.1 適體-藥物結(jié)合體

藥物的靶向性和活性的保持，是靶向藥物成功設(shè)計和制備必須考慮的因素?，F(xiàn)行的設(shè)計方案多是將藥物與配體通過共價鍵或非共價鍵相連接成為復(fù)合體。為使兩者能連接，通常要先對藥物或配體進行適當?shù)幕瘜W(xué)修飾，而修飾的結(jié)果往往會影響藥物的安全性和有效性。所以，理想的方法是提出一種可以不需要對兩者進行化學(xué)修飾的制備策略。

適體是單鏈的 DNA 或者 RNA，可以特異地并高親和性地與小分子、肽段、蛋白質(zhì)、寡聚核苷酸相結(jié)合，因此可不經(jīng)過化學(xué)修飾與藥物分子穩(wěn)定結(jié)合，在保持藥物活性的同時對受體蛋白具有特定靶向作用。Bagalkot 等[13]將多柔比星扁平的芳香環(huán)與核酸適體 A10 三維構(gòu)象中的短鏈結(jié)構(gòu)通過非共價作用連接，成功制備了適體-多柔比星結(jié)合物，此結(jié)合物的解離常數(shù) Kd= 600 nM，具有很高的穩(wěn)定性。該試驗采用的適體 A10 能特異性靶向結(jié)合前列腺癌變細胞表面抗原（PSMA）。熒光光譜法測試表明，該適體-多柔比星結(jié)合物對 LNCaP（PSMA+）細胞具有高度的特異靶向作用。同樣，核酸適體也可在蛋白藥物的靶向輸送上起到較好的作用。如分子量為 2.8 × 104的細胞毒蛋白 gelonin 可通過破壞 rRNA 的糖苷鍵阻斷蛋白質(zhì)的合成，從而有效殺死腫瘤細胞。但gelonin 本身缺少介導(dǎo)其轉(zhuǎn)移的肽區(qū)，所以不能有效進入細胞中，因此阻礙了其應(yīng)用開發(fā)。Chu 等[14]將gelonin 與 anti-PSMA 適體連接，發(fā)現(xiàn)其對 PSMA 陽性的LNCaP 細胞的毒性比 PSMA 陰性的 PC3 細胞大 600 多倍，且適體-gelonin 結(jié)合體的細胞毒性是單用 gelonin 的180 倍。此外，核酸適體還可以與酶類直接結(jié)合構(gòu)成結(jié)合體，促進靶細胞對酶的特異性內(nèi)吞作用。如 Chen 等[15]經(jīng)過篩選得到的 RNA 適體 FB4 和DNA 適體 GS24 可特異地結(jié)合大鼠成纖維細胞轉(zhuǎn)鐵蛋白的細胞外區(qū)域，將這兩種核酸適體分別與 α-L-艾杜糖醛酸酶連接構(gòu)成結(jié)合體，可有效地將 α-L-艾杜糖醛酸酶運送到缺乏該酶的細胞溶酶體內(nèi)，為酶的替代治療提供有效方法。

2.2 適體-脂質(zhì)體結(jié)合體

以前對于脂質(zhì)體的研究集中于長循環(huán)脂質(zhì)體，通過細胞的高滲透和高保留效應(yīng)（EPR effect）進行被動靶向作用，然而這種依據(jù) EPR 的靶向性仍然存在不良反應(yīng)大和選擇性不高的現(xiàn)象。為了克服被動靶向的低選擇性，以適體靶向引導(dǎo)脂質(zhì)體的藥物運輸系統(tǒng)的主動靶向成為當前研究的熱點。Cao 等[16]成功制備了以順鉑為治療藥物的核酸適體-脂質(zhì)納米囊的靶向制劑。他們選擇對核仁蛋白（在乳腺癌細胞的質(zhì)膜表面過量表達）具有較高特異親和性的核仁蛋白（nucleolin，NCL）-適體作為順鉑脂質(zhì)納米囊的“靶向載體”。用連接了 NCL-適體的順鉑脂質(zhì)體處理后的乳腺癌 MCF-7細胞存活率僅為 40.5%，而用未連接 NCL-適體的順鉑脂質(zhì)體處理，存活率高達 88.9%?？梢?，該 NCL-適體大大地提高了藥物的化療效果。同時，通過比較 MCF-7 細胞與 LNCaP細胞（細胞膜無核仁蛋白表達）對連接了 NCL-適體的順鉑脂質(zhì)體的內(nèi)吞作用，表明該適體對 MCF-7 細胞具有很好的選擇性，這樣可以大大減少順鉑脂質(zhì)體的毒副作用。

Kang 等[17]篩選得到了對白血病 CEM-CCRF 細胞具有高度親和性的 sgc8 適體，以該適體作為“靶向載體”與包裹了熒光素-右旋糖酐（FITC-Dextran，F(xiàn)D）的脂質(zhì)體相連構(gòu)成靶向脂質(zhì)體，將其與具有 sgc8 受體的 CEM-CCRF細胞和無 sgc8 受體的急性早幼粒細胞白血病 NB4 細胞共同培養(yǎng)，結(jié)果表明該靶向脂質(zhì)體對白血病 CEM-CCRF 細胞具有高度選擇性。這些結(jié)果為具有良好載藥量、安全性和靶向性的脂質(zhì)體開發(fā)奠定了實驗基礎(chǔ)。

2.3 適體-納米粒結(jié)合體

納米粒具有良好的穩(wěn)定性、可控釋性和易于工業(yè)生產(chǎn)等特點，如能兼具主動靶向性能則更適合作為藥物傳遞系統(tǒng)載體。Farokhzad 等[18]以核酸適體 A10 作為“靶向載體”，通過 PEG 與包裹有模型藥物右旋糖酐的納米粒相連構(gòu)成適體-PEG-納米粒復(fù)合物，由于適體 A10 的存在，使得前列腺癌 LNCaP 細胞（PSMA+）對該結(jié)合體的吸納能力比沒有適體的 PEG-納米粒復(fù)合物提高了 77 倍。此后該作者進一步進行了體內(nèi)試驗[19]，以接種了前列腺癌 LNCaP 細胞（PSMA+）的裸鼠為動物模型，以包裹了多西紫杉醇的納米粒為藥物載體與核酸適體 A10 通過 PEG 連接構(gòu)成結(jié)合體，一次瘤體內(nèi)注射 40 mg/kg，觀察 109 d 后發(fā)現(xiàn)注射該結(jié)合體的腫瘤體積的增長被強烈抑制，只是注射了含藥脂質(zhì)體腫瘤體積的三分之一。同時發(fā)現(xiàn)核酸適體組與單純載藥脂質(zhì)體組的裸鼠的體重下降存在明顯差異，前者下降了7.7%，而后者下降了 18%。此外，前者 109 d 的存活率是100%，而后者只有 57%。這些數(shù)據(jù)說明核酸適體-納米粒結(jié)合體具有較高的藥物療效和安全性。

2.4 適體-siRNA 結(jié)合體

siRNA 即小分子干擾 RNA（small-interference RNA，siRNA），可使某些與疾病發(fā)生有關(guān)的特定基因沉默或表達水平降低，從而阻斷某種特定蛋白質(zhì)的表達，有效治療疾病。目前 siRNA 類作為藥物的研究已在多種疾病治療領(lǐng)域取得了較好進展[20]。然而，siRNA 治療技術(shù)也存在著一些需要解決的問題，怎樣有選擇性地將外源性小分子 RNA 輸送到病變細胞仍然是影響該技術(shù)進一步應(yīng)用到臨床治療上的主要障礙[21-22]。

靶向性傳遞 siRNA 不僅可提高生物利用度，減少使用量，更重要的是可避免對正常細胞產(chǎn)生毒副作用。目前已有報道將核酸適體作為“靶向載體”介導(dǎo) siRNA 的輸送。核酸適體與 siRNA 結(jié)合的構(gòu)型設(shè)計常見的有兩種：一種是將鏈霉親和素-生物素復(fù)合物作為連接核酸適體和siRNA 的“橋”（圖 1A）[23]，這種結(jié)構(gòu)能夠有效地、特異性地進行siRNA 的輸送，即克服了脂質(zhì)體輸送 siRNA 的非特異性，又避免了以肽為輸送載體的工藝復(fù)雜性。第二種結(jié)構(gòu)更為簡單（圖 1B）[24]，核酸適體與 siRNA 直接構(gòu)成的結(jié)合體作為傳遞的系統(tǒng)。當這種結(jié)合體進入靶細胞后，在 dsRNA 酶Dicer 的作用下將 siRNA 從結(jié)合體上切下。McNamara 等[25]將核酸適體 A10 與 siRNA 制成結(jié)合體，干擾前列腺腫瘤LNCaP（PSMA+）細胞生存所需基因的表達，在體外實驗中可以觀察到腫瘤細胞的生長受到明顯抑制。Zhou 等[26]篩選出 HIV 的 gp120 包膜蛋白的特異性核酸適體，并制備了與相關(guān) siRNA 的結(jié)合體，成功地抑制 HIV 病毒的復(fù)制和傳染能力。該研究制備的結(jié)合體中的適體和siRNA 都對 gp120 蛋白的基因表達有抑制作用，在達到靶向性的同時也起到了協(xié)同作用的效果。

圖1 核酸適體與 siRNA 結(jié)合的構(gòu)型

3 結(jié)語

適體從應(yīng)用于藥物篩選、蛋白檢測、生物傳感器到如今作為藥物治療的“靶向載體”，越來越多的科研人員投身于適體技術(shù)及其應(yīng)用的研究之中，并取得了重大進展，為核酸適體在藥物靶向制劑的應(yīng)用開拓了美好前景。然而，在此領(lǐng)域仍然面臨著很大的挑戰(zhàn)，特別是在癌癥和病毒感染的治療方面，還存在藥物或載體與核酸適體連接、適體與靶點結(jié)合強度以及生產(chǎn)擴大化等方面的問題，且安全性仍待進一步評價。

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