張志宏,孫 博,金藝鵬,林德貴

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀 100193)

馬拉色菌屬為人類及溫血?jiǎng)游矬w表正常菌群之一,也是條件致病菌。該菌分為7種,對(duì)于人類來(lái)說(shuō)糠秕馬拉色是花斑癬、脂溢性皮炎的主要病原。犬馬拉色菌性外耳炎是犬臨床常見(jiàn)的一種外耳道疾病,由于犬外耳道的特殊構(gòu)造、耳毛多、外耳道耵聹腺、脂肪腺分泌的異常,加之內(nèi)外環(huán)境的改變而使原本是常駐菌的馬拉色菌發(fā)生過(guò)度生長(zhǎng),造成馬拉色菌性外耳炎。從上世紀(jì)起,抑制馬拉色菌的藥物研究主要是以抗真菌劑如酮康唑、氟康唑?yàn)橹?。中藥以其不易產(chǎn)生耐藥性、低毒低副作用的特點(diǎn)越來(lái)越引起各國(guó)真菌學(xué)者的重視。本試驗(yàn)選取17種具有明顯抑制真菌作用的中藥的活性成分對(duì)犬外耳炎分離的4種馬拉色菌進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn),同時(shí)以臨床常用抗真菌藥氟康唑做為對(duì)照,觀察抑菌效果,篩選出效果較好的中藥活性成分,為馬拉色菌相關(guān)疾病藥物治療提供新幫助。

1 材料與方法

1.1 菌株 北京觀賞動(dòng)物醫(yī)院2007年1～12月的犬外耳炎化驗(yàn)中,在Leeming&Notman培養(yǎng)基初步分離出馬拉色菌,又經(jīng)過(guò)SDA生長(zhǎng)試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、七葉苷利用試驗(yàn)以及在不同吐溫上的生長(zhǎng)試驗(yàn),最終鑒定出4個(gè)馬拉色菌菌種,其中厚皮馬拉色菌16株,合軸馬拉色菌11株,限制馬拉色菌3株,鈍形馬拉色菌2株。

1.2 供試藥物 肉桂醛、檸檬醛、土槿皮乙酸、厚樸酚、麝香草酚、鹽酸小檗堿、丁香酚、大黃酚、肉桂酸、丹皮酚、丹參酮 II、黃芩苷、白藜蘆醇、莪術(shù)醇、兒茶素、苦參堿、酮康唑、氟康唑、鹽酸特比萘芬等標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.3 方法 本試驗(yàn)參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI)制定的M-27A標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行微量液基稀釋法藥敏試驗(yàn)。

1.3.1 Leeming&Notman液體培養(yǎng)基制備 蛋白胨1.0 g,葡萄糖1.0 g,牛膽鹽 8.0 g,酵母浸膏2.0 g,甘油 1.0 g,吐溫-605.0 g,橄欖油 30mL,氯霉素50 mg,加入1000mL蒸餾水混勻,115℃高壓滅菌15 min,備用。

1.3.2 菌液制備 取馬拉色菌于試驗(yàn)前35℃培養(yǎng)24 h活化,活化2次,使之處于指數(shù)生長(zhǎng)期后期,挑取少量菌落稀釋于滅菌生理鹽水中,血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)調(diào)整濃度為1×104～5×104CFU/mL,再用Leeming&Notman液體培養(yǎng)基調(diào)整至2.5×103±1.0×103CFU/mL。

1.3.3 藥液及藥敏板配制 將17種中藥活性成分和氟康唑、酮康唑、鹽酸特比萘芬精確稱量后用二甲基亞砜(DMSO)溶解成1×105μg/mL原液備用。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,于每排1～11孔分別加入Leeming&Notman液體培養(yǎng)基100μL。原藥用培養(yǎng)基稀釋100倍于第一孔加入100μL,2～10孔依次倍比稀釋。1～11孔加菌懸液100μL,11號(hào)孔不加藥液作為生長(zhǎng)對(duì)照,12孔加入Leeming&Notman液體培養(yǎng)基200μL作為空白對(duì)照。每株菌每種藥物3組平行對(duì)照。藥敏試驗(yàn)共重復(fù)2次。

2 試驗(yàn)結(jié)果

MIC值判定:32℃孵育每隔24 h觀察記錄結(jié)果連續(xù)觀察7 d,肉眼觀察與生長(zhǎng)對(duì)照孔相比明顯減少為MIC值。17種中藥活性成分對(duì)馬拉色菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

3 討論

近年來(lái)對(duì)中藥抗真菌方面的研究和報(bào)道逐漸增多,國(guó)內(nèi)外對(duì)這一課題的重視程度也在與日俱增。在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中,很早就有關(guān)于應(yīng)用天然藥物及其提取物治療癬證的記錄。本研究根據(jù)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用實(shí)踐及文獻(xiàn)記載選取了17種具有抗真菌活性的天然藥物的活性成分針對(duì)馬拉色菌進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn),尋找效果明顯物質(zhì)為臨床用藥及進(jìn)一步深入研究提供參考。

本試驗(yàn)對(duì)從患外耳炎犬耳道中分離出的馬拉色菌進(jìn)行研究,結(jié)果表明,這17種中藥活性成分中,對(duì)馬拉色菌具較強(qiáng)抑制作用的有肉桂醛、檸檬醛和丁香酚。其中尤以肉桂醛抑菌效果最好,但其效果稍遜于酮康唑、氟康唑。由于氟康唑、酮康唑等對(duì)馬拉色菌僅有抑制作用,極易產(chǎn)生耐藥性而失去治療作用。而肉桂醛等中藥活性成分不易產(chǎn)生耐藥性,且對(duì)馬拉色菌有殺滅作用,因此其應(yīng)用前景十分樂(lè)觀。有報(bào)道稱鹽酸特比萘芬對(duì)皮膚癬菌殺菌力強(qiáng)[2],本試驗(yàn)結(jié)果顯示其抗馬拉色菌的效果一般。而各藥物對(duì)分離出的4種馬拉色菌的藥敏結(jié)果并無(wú)顯著差異。

表1 17種中藥活性成分對(duì)馬拉色菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果(微量液基稀釋法)

土槿皮乙酸、麝香草酚、苦參堿、兒茶素、莪術(shù)醇、膽苦苷、丹皮酚、丹參酮Ⅱ 、大黃酚、白藜蘆醇、黃芩苷、肉桂酸對(duì)馬拉色菌無(wú)明顯抑制作用。雖然這些中藥單體均有文獻(xiàn)記載具有抗真菌作用,但本試驗(yàn)中它們的活性成分對(duì)馬拉色菌的作用效果并不明顯。筆者認(rèn)為其原因可能是由于馬拉色菌與其他真菌的種屬差異有關(guān)。另外藥物活性成分與有效成分的差別及中藥本身成分的復(fù)雜性也是重要的影響因素。

念珠菌對(duì)唑類藥物有拖尾現(xiàn)象,結(jié)果不易判讀;而馬拉色菌藥敏試驗(yàn)無(wú)明顯的拖尾現(xiàn)象,結(jié)果容易判讀。目前,對(duì)于馬拉色菌體外藥敏試驗(yàn)還沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化方案,特別是中藥抗馬拉色菌的藥敏試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)方案和參考標(biāo)準(zhǔn)目前仍是空白。筆者在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),將CLSI制定的M-27A標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)用到中藥活性成分抗馬拉色菌試驗(yàn)中,同樣具有試驗(yàn)結(jié)果易分析、方便、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),這將有利于抗真菌中藥藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化,推動(dòng)中藥抗真菌作用研究。

[1]National Committee for Clinical Laboratory Standards.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts.A pproved standard NCCLS document M27-A[M].Wayne,PA,1997.

[2]金藝鵬,林德貴.鹽酸特比萘芬對(duì)犬貓皮膚真菌病的療效觀察[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2003,39(6):21-23.

[3]王文莉,王禮瑞,李世蔭,等.酵母菌的NCCLS藥敏試驗(yàn)方法及其應(yīng)用[J].中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志,1997(20):84-86.

[4]Faergemann J,ergbrant I M,ohse M,et al.Seborrhoeic dermatitis and Pityrosporum(Malassezia)folliculitis:characterization of inflammatory cells and mediators in the skin by immunohistochemistry[J].Br J Dermatol,2001(144):549-556.

[5]John C.Angus Otic cytology in health and disease[J].Vet Clin Small Anim,2004(34):411-424.

[6]黃欣.酮康唑、特比萘芬聯(lián)合重要單體抗馬拉色菌的試驗(yàn)研究[D].上海:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué),2005.

[7]朱敏.中草藥及其單體抗馬拉色菌作用的研究[D].上海:復(fù)旦大學(xué),2003.

[8]夏兆飛,郝力力.犬貓耳炎的病因[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2003,39(6):45-46.

[9]宋軍,李鶴玉,趙小秋,等.丁香酚抗真菌作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志,1996,10(4):203-204.

[10]張文平,劉志春,劉建新.微量法測(cè)定肉桂醛、檸檬醛體外抗深部真菌活性[J].贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2004,24(4):365-366.