王自力,趙詩(shī)潔,陳忠瓊,涂建國(guó),吳利娟,魏學(xué)良,李樹(shù)明,田茂春

(西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,重慶 北碚 400715)

“衛(wèi)氣營(yíng)血辨證”由清代溫病醫(yī)家葉天士創(chuàng)立,認(rèn)為氣分證是溫?zé)岵〉姆乐侮P(guān)鍵。白虎湯是防治氣分證的經(jīng)典方之一,具有祛除邪氣,恢復(fù)正氣功效。通過(guò)制作家兔氣分證模型,利用白虎湯構(gòu)建中藥復(fù)方進(jìn)行防治,觀測(cè)家兔體溫、臨床癥狀和血清抗氧化指標(biāo)的變化,為研制防治動(dòng)物氣分證的中獸藥提供理論和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 健康新西蘭家兔21只,體重1.1～1.8 kg,雌雄不拘,購(gòu)自重慶市金秋兔業(yè)有限公司。隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、中藥組,每組 7只。

1.2 藥品及儀器

1.2.1 中藥復(fù)方注射劑制作 生石膏50 g、知母24 g、大黃 20 g、金銀花 20 g 、生甘草 5 g,購(gòu)自重慶市北碚區(qū)全興大藥房。按文獻(xiàn)[1]制作中藥注射劑,即經(jīng)浸泡、水煎、醇提后,再經(jīng) 126℃、0.14 MPa高壓滅菌30 min后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試劑及藥品 大腸桿菌內(nèi)毒素(L-2880),購(gòu)自Sigma公司;超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒(批號(hào)20090323)、丙二醛(MDA)測(cè)試盒(批號(hào)20090323)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)(批號(hào)20081127)測(cè)試盒,均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2.3 儀器設(shè)備 離心機(jī)(TGL-16G型、上海安亭科學(xué)儀器廠)、可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)(22pco4160型、上海棱光技術(shù)有限公司)、酸度計(jì)(PHS-3C型、成都世紀(jì)方舟科技有限公司)。

1.3 處理方法 家兔正常飼養(yǎng)3 d后,測(cè)量肛溫3次,取平均值為基礎(chǔ)體溫。用無(wú)菌生理鹽水將內(nèi)毒素配制成濃度為15μg/mL溶液,-20℃保存?zhèn)溆谩Ｗ⑸淝?7℃水浴20 min后,按0.5mL/kg體重經(jīng)耳緣靜脈注射。對(duì)照組注入0.5/kg體重?zé)o菌生理鹽水作為對(duì)照。攻毒前2 h和攻毒后,中藥組家兔按照1.5mL/kg體重經(jīng)腹腔注射中藥注射液,對(duì)照組和模型組分別給予相同劑量無(wú)菌生理鹽水。

1.4 測(cè)定指標(biāo) 于注射內(nèi)毒素后0.5、1、1.5、2 h和2.5 h時(shí)測(cè)量肛溫,2.5 h后心臟采血,3000 r/min離心10 min分離血清,-20℃保存?zhèn)錅y(cè);血清SOD、MDA、GSH-Px含量測(cè)定參照說(shuō)明書(shū)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 氣分證家兔癥狀變化 對(duì)照組:體溫正常,精神狀態(tài)良好,呼吸和心跳均保持正常,被毛順滑,結(jié)膜無(wú)充血,剖檢觀察心、肝、脾、肺、腎、腸道組織等臟器均正常,未見(jiàn)充血和出血斑點(diǎn),皮下、腰大肌未見(jiàn)出血。

模型組:注射內(nèi)毒素0.5 h后體溫開(kāi)始上升,出現(xiàn)被毛雜亂,倦怠蜷縮,至2 h左右,結(jié)膜充血;呼吸急促,心率加快,飲水增加;口色鮮紅;耳廓血管充血擴(kuò)張,2.5 h后剖檢觀察見(jiàn)心、肝、脾、肺、腎等臟器充血,但未見(jiàn)出血斑點(diǎn),皮下、腰大肌未見(jiàn)明顯出血。

中藥組:注射內(nèi)毒素0.5 h后體溫升高,注射中藥注射劑后蜷縮聳毛;呼吸心率加快;體溫升高;飲水增多,結(jié)膜充血等癥狀減輕,至2.5 h時(shí)恢復(fù)到正常水平。剖檢觀察心、肝、脾、肺、腎等臟器無(wú)充血或有少數(shù)充血,均未見(jiàn)出血斑點(diǎn),皮下、腰大肌無(wú)出血。

2.2 氣分證家兔體溫的變化 見(jiàn)表1。

表1 家兔體溫變化 (n=7) (℃)

由表1可知,各組基礎(chǔ)體溫?zé)o差異。0.5 h和1 h時(shí),中藥組和模型組家兔體溫均顯著或極顯著高于對(duì)照組(P＜0.05或P＜0.01),且兩組間無(wú)顯著差異;1.5 h時(shí),模型組和中藥組體溫開(kāi)始下降,且與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05);2 h時(shí),中藥組家兔體溫極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01),且與模型組無(wú)差異;2.5 h時(shí),模型組家兔體溫顯著高于對(duì)照組(P＜0.05),且中藥組家兔體溫均極顯著高于對(duì)照組和模型組(P＜0.01)。

2.3 血清抗氧化指標(biāo)含量的變化 見(jiàn)表2。

表2 家兔血清抗氧化指標(biāo)含量變化(n=7)

由表2可知,中藥組家兔血清SOD水平顯著高于對(duì)照組(P＜0.05),且極顯著高于模型組(P＜0.01);模型組家兔血清MDA水平顯著高于對(duì)照組(P＜0.05),而中藥組極顯著低于模型組(P＜0.01)且與對(duì)照組無(wú)顯著差異;中藥組家兔血清GSH-Px水平顯著低于對(duì)照組(P＜0.05),但模型組與對(duì)照組、中藥組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 分析與討論

3.1 中藥復(fù)方對(duì)氣分證家兔臨床癥狀及體溫的影響 溫病氣分階段的特點(diǎn)是邪氣雖盛而正氣亦強(qiáng),正邪交爭(zhēng)激烈。模型組家兔臨床癥狀、剖檢結(jié)果和體溫變化表明,家兔處于氣分證而未進(jìn)入營(yíng)血分證,說(shuō)明家兔氣分證模型制作成功。研究表明,內(nèi)毒素可破壞血小板和紅細(xì)胞,損傷毛細(xì)血管壁,導(dǎo)致失水液酸堿平衡紊亂,引起內(nèi)臟器官不同程度損傷[2],常用于動(dòng)物氣分證模型的制作[3]。

按照“到氣清氣”[4]的治療原則,采用辛苦寒涼類(lèi)中藥清解氣分證。中藥組上述癥狀較模型組輕,說(shuō)明在攻毒前注射中藥復(fù)方對(duì)病邪具有一定抵抗作用,且體內(nèi)正邪斗爭(zhēng)激烈使家兔一度產(chǎn)生體溫升高、呼吸加快等癥狀;而經(jīng)攻毒后注射中藥復(fù)方,臨床癥狀及體溫等均恢復(fù)正常,說(shuō)明中藥復(fù)方具有解氣分熱之功效。研究表明,中藥復(fù)方中的大黃可降低能量代謝減少產(chǎn)熱使體溫下降[5];石膏可抑制體溫調(diào)節(jié)中樞的亢進(jìn)而解熱,并抑制發(fā)汗中樞[6],解熱而不發(fā)汗,故無(wú)傷津之弊。

3.2 中藥復(fù)方對(duì)氣分證家兔血清SOD、MDA和GSH-Px水平的影響 氣分證是正盛邪實(shí),正邪相爭(zhēng)激烈,陽(yáng)熱亢盛的里熱證。中獸醫(yī)學(xué)中“正氣”既包括機(jī)體抗御致病因子(如內(nèi)毒素等)的能力與物質(zhì)(如SOD、GSH-Px、免疫學(xué)物質(zhì)等)[7];且機(jī)體自由基的產(chǎn)生和清除保持動(dòng)態(tài)平衡,若此平衡被破壞后可引起細(xì)胞損傷和疾病發(fā)生等連鎖反應(yīng)。

3.2.1 對(duì)血清SOD水平的影響 SOD是機(jī)體中的一種重金屬酶,能清除超氧陰離子自由基,發(fā)揮抗炎功效,對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要作用。本研究表明,氣分證家兔血清SOD含量保持在正常水平,說(shuō)明模型組家兔機(jī)體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和清除處于平衡狀態(tài),符合氣分證時(shí)機(jī)體內(nèi)邪氣盛,而正氣亦強(qiáng)的特點(diǎn),進(jìn)一步說(shuō)明家兔氣分證模型的建立是成功的。中藥組家兔治療后血清SOD水平大幅上升,說(shuō)明中藥復(fù)方具有增強(qiáng)機(jī)體清除氧自由基能力,即增強(qiáng)機(jī)體正氣和祛除邪氣能力。現(xiàn)有研究表明:中藥復(fù)方中大黃(主要為蒽醌類(lèi)衍生物大黃素)具有良好的抗炎、清除氧自由基的抗氧化作用[8]。知母中的知母多糖對(duì)紅細(xì)胞膜自氧化和H2O2所致的紅細(xì)胞氧化溶血具有顯著抑制作用而發(fā)揮抗氧化作用[9]。

3.2.2 對(duì)血清MDA水平的影響 MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化中產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物,可引起黏膜損傷和激活補(bǔ)體系統(tǒng),使巨噬細(xì)胞釋放大量炎癥介質(zhì)產(chǎn)生一系列連鎖損傷反應(yīng)[10]。本研究表明,模型組家兔血清中MDA水平出現(xiàn)顯著升高,而中藥組MDA含量則保持正常水平,相關(guān)研究[11]也證實(shí)了本研究結(jié)果;研究表明氣分證家兔體內(nèi)存在氧自由基代謝紊亂,而經(jīng)中藥復(fù)方可維持機(jī)體氧自由基的產(chǎn)生和清除能力保持平衡。中藥復(fù)方中的金銀花具有抑菌抗病毒、解熱抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用,可明顯減輕肝臟病理?yè)p傷[12]。

3.2.3 對(duì)血清GSH-Px水平的影響 GSH-Px具有清除體內(nèi)過(guò)氧化氫和許多有害的過(guò)氧化產(chǎn)物,阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化連鎖反應(yīng),具有保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整的功效。本研究表明,模型組家兔血清GSHPx水平略低于對(duì)照組但無(wú)顯著差異,說(shuō)明氣分證階段家兔機(jī)體清除體內(nèi)過(guò)氧化氫和有害過(guò)氧化物能力仍保持正常,體現(xiàn)氣分證動(dòng)物體內(nèi)正氣尚強(qiáng)的特點(diǎn);而中藥組GSH-Px的活性未出現(xiàn)增強(qiáng)作用,提示中藥復(fù)方可能通過(guò)其他途徑,如通過(guò)增強(qiáng)SOD等抗氧化酶,降低 MDA水平來(lái)發(fā)揮祛除邪氣功效,與SOD協(xié)同輔助作用等因素[13]有關(guān)。

綜上所述,中藥復(fù)方對(duì)氣分證家兔具有增強(qiáng)機(jī)體正氣作用,如促使臨床癥狀恢復(fù)正常,提高SOD水平、降低MDA水平達(dá)到增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力,其作用機(jī)制需進(jìn)一步研究,以闡釋氣分證實(shí)質(zhì)及中藥調(diào)控機(jī)制。

[1]孫志云,陳選京.淺談中藥湯劑的正確制備方法[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2002,5:21-22.

[2]陳可冀,張之南,梁子鈞,等.血瘀證與活血化瘀研究[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1990:153.

[3]吳仕九,楊運(yùn)高,佟麗,等.溫病濕熱證動(dòng)物模型的研制及清熱祛濕法機(jī)理的探討[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技,1999,26(2):65-67.

[4]陳楊榮,陳曉玲,鄭旭.溫病氣分證應(yīng)注重清熱養(yǎng)陰與活血化瘀[J].福建中醫(yī)學(xué)報(bào),1999,9(3):8.

[5]郭昌燕.大黃對(duì)體溫中樞調(diào)節(jié)介質(zhì)cAMP的影響[J].中國(guó)中藥雜志,1989,14(6):51.

[6]亢志蘭.略談石膏之藥理作用及臨床應(yīng)用[J].光明中醫(yī),2006,5(21):16-17.

[7]李慶生,袁嘉麗,陳文慧.中醫(yī)學(xué)“正氣”應(yīng)包括微生態(tài)與免疫平衡[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,28(3):1-3.

[8]郭陽(yáng),周林,謝曉華.大黃素對(duì)大鼠牙周組織抗氧化作用[J].中國(guó)公共衛(wèi)生,2007,5(3):601-602.

[9]王德潔,李娟,巨艷紅,等.知母多糖的體外抗氧化作用研究.[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2008,22(2):31-32.

[10]王春榮,程永剛,曾津.腸功能恢復(fù)湯對(duì)MODS大鼠細(xì)菌和內(nèi)毒素移位及血清MDA和SOD含量的影響[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào),2009,30(1):219-224.

[11]王艷萍,祁克宗,涂健,等.內(nèi)毒素對(duì)仔雞血漿 SOD活性及M DA水平的影響[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2007,27(5):63-65.

[12]關(guān)炳峰,譚軍,周志娣.金銀花提取物的抗氧化作用與其綠原酸含量的相關(guān)性研究[J].研究與探討,2007,28(10):127-129.

[13]張家留,俞雷,徐鑫榮.還原型谷胱甘肽對(duì)內(nèi)毒素休克兔的保護(hù)作用[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué),2004,32(10):288-291.