孫巍巍，包海鷹

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

松杉靈芝 （Ganoderma tsugae Murr.） 為擔(dān)子菌綱 （Basidiomycetes）、 多孔菌目 （Polyporales）、 多孔菌科（Polyporaceae）、靈芝屬 （Ganoderma）真菌，子實(shí)體一年生，是1種珍貴的藥用真菌。靈芝具有多種活性物質(zhì)，其中多糖和三萜被認(rèn)為是主要藥效成分。大量報(bào)道表明靈芝具有廣泛的藥理作用，例如保肝、抗腫瘤、抗微生物、抗高血壓、抗HIV－1及HIV－l蛋白酶、鎮(zhèn)靜、抗疲勞、耐缺氧、抗氧化作用等[1]，有學(xué)者對(duì)松杉靈芝子實(shí)體熱水提取物和甲醇提取物的抗氧化性進(jìn)行研究，結(jié)果表明這兩種提取物都具有較好的抗氧化活性[2，3]。本實(shí)驗(yàn)采用3種方法對(duì)松杉靈芝子實(shí)體不同有機(jī)溶劑提取物進(jìn)行體外抗氧化活性研究，為松杉靈芝的藥用價(jià)值開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料

松杉靈芝子實(shí)體采自吉林省長(zhǎng)白山，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物研究所圖力古爾教授提供并鑒定。

1.2 主要儀器設(shè)備

PL303電子天平，梅特勒－托利多儀器有限公司；HH CP－O1W二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TU－1800紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Polytron組織勻漿器，上海東富龍有限公司；GL－20G－Ⅱ離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及藥品

1,1－二苯基－2－苦基肼自由基 （·DPPH） 和細(xì)胞色素C（CytC）均購(gòu)自Sigma公司；抗壞血酸 （Vc）為食品級(jí)；三羥甲基氨基甲烷 （Tris）、FeSO4、 三氯醋酸 （TCA）、 硫化巴比妥酸 （TBA）、 無水乙醇、CuSO4、 Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O和硫脲等均為分析純。

2 方法

2.1 供試藥品的制備

將1.5 kg松杉靈芝子實(shí)體粉碎，依次用石油醚、氯仿、甲醇和蒸餾水回流提取3次，除了石油醚的提取溫度是35℃外，其它提取溫度均為60℃，每次提6 h，合并提取液，過濾，濃縮，干燥，分別得到石油醚提取物、氯仿提取物、甲醇提取物和水提取物。稱取松杉靈芝石油醚提取物、氯仿提取物、甲醇提取物、水提取物各100 mg，分別用氯仿、氯仿、甲醇和蒸餾水定容于50 mL容量瓶中，配成濃度為2 mg·mL-1的樣品母液，然后將樣品母液用溶劑逐級(jí)稀釋成濃度為 2 mg·mL-1、 1 mg·mL-1、 0.5 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、 0.125 mg·mL-1、 0.0625 mg·mL-1的樣品溶液待用。

2.2 抗氧化試劑的配制

2.2.1 清除·DPPH自由基試劑的配制

·DPPH溶液：準(zhǔn)確稱取0.01 g的·DPPH，用無水乙醇定容至50 mL容量瓶中作為母液，取10 mL母液用無水乙醇定容于50 mL容量瓶中，最終濃度為0.04 mg·mL-1，避光，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2.2 大鼠腦勻漿脂質(zhì)過氧化試劑的配制

Tris-HCl緩沖液 （20 mmol·L-1， pH7.4）： 稱 Tris 0.24228 g，加 50 mL蒸餾水，HCl 0.17 mL，稀釋到 50 mL， 取 HCl 42 mL與 50 mL Tris混勻備用；FeSO4·7H2O（10 μmol·L-1）溶液： 稱 FeSO4·7H2O 0.0508 g， 加 10 mL Tris-HCl緩沖液 （20 mmol·L-1， pH7.4）， 用時(shí)稀釋 1000倍；0.1 mmol·L-1的 Vc溶液： 取 Vc 0.0176 g， 加 10 mL Tris-HCl緩沖液 （20 mmol·L-1， pH7.4）， 用時(shí)稀釋 100倍；三氯醋酸 （TCA 28%）溶液：稱三氯醋酸2.8 g，加10 mL Tris-HCl緩沖液；硫代巴比妥酸 （TBA 1%）溶液：稱 TBA 0.2 g，加 20 mL Tris-HCl緩沖液；陽性對(duì)照（BHA 500 μg·mL-1）： 準(zhǔn) 確稱 取 BHA 50 mg， 加 10 mL Tris-HCl緩沖液。

2.2.3 清除羥自由基試劑的配制

磷酸鈉鹽緩沖液 PBS （0.15 mmol·L-1， pH7.4）： 取Na2HPO4·12H2O 0.0042 g， 加入蒸餾水77.4 mL， 取NaH2PO4·2H2O 0.0023 g， 加蒸餾水 100 mL， 從中取 22.6 mL與上列溶液混勻，可放于4℃冰箱保存；Vc（100 μmol·L-1）溶液：稱Vc 0.0176 g，加10 mL磷酸鈉鹽緩沖液 （0.15 mmol·L-1， pH7.4）， 用時(shí)稀釋 100 倍； CuSO4（100 μmol·L-1）溶液： 稱取 CuSO4·5H2O 0.039 g， 加10mL 磷酸鈉鹽緩沖液 （0.15 mmol·L-1，pH7.4）， 用時(shí)稀釋 100倍；細(xì)胞色素 C （12 μmol·L-1）： 每2毫升 15 mg， 稀釋 50 倍備用； 陽性對(duì)照 （硫脲2 μg·mL-1）： 稱硫脲2 mg， 加磷酸鈉鹽緩沖液 （0.15 mmol·L-1， pH7.4）10 mL， 用時(shí)稀釋100倍。

2.3 抗氧化的測(cè)定

2.3.1 清除·DPPH自由基的測(cè)定

將石油醚提取物、氯仿提取物、甲醇提取物、水提取物溶液分別分為A、B、C三組。A組：2 mL樣品溶劑和2 mL·DPPH溶液；B組：2 mL樣品溶液和2 mL·DPPH溶液；C組：2 mL樣品溶液和2 mL無水乙醇。加入反應(yīng)液后搖勻，于室溫避光靜置30 min，轉(zhuǎn)移至比色皿內(nèi)，在517 nm處測(cè)定吸光度值。每組做6個(gè)平行，計(jì)算各樣品對(duì)·DPPH的清除率[4]。各樣品對(duì)·DPPH自由基的清除能力(SA)公式為:

SA=[A-(B-C)]/A×100%

式中：A、B、C分別為A組、B組、C組所測(cè)得的吸光度值。

2.3.2 大鼠腦勻漿脂質(zhì)過氧化作用的測(cè)定

大鼠用乙醚麻醉至昏迷，快速斷頭處死后，迅速剝離腦組織，4℃生理鹽水反復(fù)沖洗，洗去血污，濾紙吸去生理鹽水，稱腦重量。將腦剪成小塊后，用Polyron電動(dòng)勻漿器， 加入冰凍 Tris-HCl緩沖液 （20 mmol·L-1，pH7.4）得1/10（重量體積比）腦勻漿，冰浴中迅速用勻漿機(jī)以18000 r·min-1的速度，打漿3次，每次10 s，間隔30 s，制備成腦勻漿 （1∶10， w·v-1）， 4℃離心 （2000 r·min-1， 20 min），將勻漿中的上清液均分為1 mL，加入1 mL待測(cè)樣品， 1 mL 10 μmol·L-1的 FeSO4和 1 mL 0.1 mmol·L-1的 Vc的試管中，于37℃保溫1 h，保溫結(jié)束后，加入1.0 mL三氯醋酸 （TCA，28%）終止反應(yīng)，再加1.5 mL硫化巴比妥酸 （TBA，1%），于100℃加熱15 min，離心除去蛋白質(zhì)后，于532 nm測(cè)定丙二醛 (MDA)-TBA復(fù)合物的吸光度， 抑制率 （P） 公式[5]為：

P=(A-A1)/A×100%

式中：A為對(duì)照的吸光度；A1含待測(cè)樣品體系的吸光度。

2.3.3 羥自由基清除活性的測(cè)定

精密量取 3.0 mLPBS （0.15 mmol·L-1， pH7.4， 下同）和30μL CuSO4于試管中，混勻作空白參比管；精密量取PBS 3.0 mL、 CuSO430μL、 維生素 C 30μL、 細(xì)胞色素 C 60μL、蒸餾水0.5 mL作為對(duì)照；精密量取PBS 3.0 mL，CuSO430μL、 維生素 C 30μL、 細(xì)胞色素 C 60μL， 各待測(cè)樣品0.5 mL作為待測(cè)組；精密量取PBS 3.0 mL、CuSO430μL、 維生素 C 30μL、 細(xì)胞色素 C 60μL、 硫脲 3μL作為陽性對(duì)照。將上述試管同時(shí)置于25℃恒溫水槽中保溫90 min后，在550 nm測(cè)吸光度值A(chǔ)。每處理重復(fù)5次，硫脲作為陽性對(duì)照，將空白抑制率視為100%。羥自由基清除活性 （A） 公式[6]為：

A=(T-T2)/(T-T1)×100%

式中：T為羥自由基 （·OH）產(chǎn)生體系的透光值；T1為對(duì)照體系 （無·OH）的透光值；T2為含待測(cè)樣品體系的透光值。

3 結(jié)果與分析

3.1 清除·DPPH的測(cè)定

松杉靈芝提取物清除·DPPH自由基的情況見表1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，各提取物都具有一定清除·DPPH活力的能力，隨著提取物濃度的增加，清除率增高，可見提取物的抗氧化性與提取物的濃度呈量效關(guān)系。甲醇組的抗氧化能力略高于水組，在2 mg·mL-1時(shí)的清除率分別為68.73%和65.28%；石油醚組次之，最大清除率為57.78%；氯仿組清除·DPPH的能力最低，最大清除率為51.56%。

表1 松杉靈芝提取物清除·DPPH自由基的能力

3.2 體外大鼠腦勻漿脂質(zhì)過氧化作用的測(cè)定

松杉靈芝提取物對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制情況見表2。

從表2中可知，各層提取物的抑制率都隨濃度的提高而增大，各提取物都具有抑制脂質(zhì)過氧化效果，甲醇層的抑制能力最強(qiáng)，在2 mg·mL-1時(shí)的抑制率為64.55%，稍高于水層的最大抑制率59.72%，然后依次是石油醚層和氯仿層，兩者的最大抑制率相近，分別為55.63%和49.31%。在濃度為 0.5 mg·mL-1時(shí)，陽性藥 BHA的抑制率達(dá)到81.71%，抑制作用均大于松杉靈芝各層提取物。

表2 松杉靈芝提取物對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制能力

3.3 羥自由基清除活性的測(cè)定

松杉靈芝提取物清除羥自由基能力見表3。

表3 松杉靈芝提取物清除羥自由基能力

從表3可以看出，各提取液都具有清除·OH能力，且都具有較好的量效關(guān)系。水層的清除能力最強(qiáng)，在濃度為2 mg·mL-1時(shí)的清除率達(dá)到100%，其余各組的的最大清除率分別為甲醇層81.26%、氯仿層75.07%、石油醚層60.34%。陽性藥硫脲在濃度為 2 μg·mL-1時(shí)的清除率為76.78%，水層和甲醇層在2 mg·mL-1時(shí)清除·OH的能力均超過陽性藥，尤其是水層具有極好的清除效果。石油醚層的清除效果最弱，在濃度達(dá)到1 mg·mL-1時(shí)，清除率隨濃度的增大不再明顯提高。

4 小結(jié)與討論

松杉靈芝不同溶劑提取物都具有較好的抗氧化作用，并且隨著提取物濃度的增加，抗氧化作用也逐漸增強(qiáng)。各組對(duì)·DPPH的清除能力：甲醇組＞水組＞石油醚組＞氯仿組；對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制能力：甲醇組＞水組＞石油醚組＞氯仿組；對(duì)·OH的清除能力：水組＞甲醇組＞氯仿組＞石油醚組。在清除·DPPH的實(shí)驗(yàn)中，各層的提取物均具有清除·DPPH的能力，·DPPH是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，若受試物能夠清除它，則提示受試物具有減低羥基自由基、烷基自由基或過氧自由基的有效濃度和打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)的作用[7]；在抑制脂質(zhì)過氧化的實(shí)驗(yàn)里，各層提取物均具有一定的抑制作用，可能與各提取物中含有酚類、三萜類、多糖類等抗氧化物質(zhì)的含量及組成有關(guān)；在清除·OH的實(shí)驗(yàn)中，有學(xué)者研究表明松杉靈芝子實(shí)體熱水提取物對(duì)羥自由基具有很好的清除力[2]，與本實(shí)驗(yàn)中水層對(duì)羥自由基具有很好的清除效果相符，表明松杉靈芝提取液清除·OH的物質(zhì)極性較大，能更多溶于水和甲醇中。從以上抗氧化實(shí)驗(yàn)推測(cè)，不同溶劑提取物清除自由基的種類不同，說明其抗氧化組份不同，在甲醇組中清除·DPPH和抑制脂質(zhì)過氧化的物質(zhì)多，在水層中清除·OH的物質(zhì)多，由于提取液成分復(fù)雜，各物質(zhì)之間可能相互影響，具體的清除物質(zhì)成分還需近一步研究。眾所周知，自由基損傷參與多種疾病的病理生理過程，如炎癥、免疫失調(diào)、動(dòng)脈粥樣硬化、惡性腫瘤、衰老等，研究和開發(fā)抗氧化劑和自由基清除劑對(duì)疾病的防治有重大意義。目前國(guó)內(nèi)外也已將抗氧化檢測(cè)用于抗衰老等保健食品的評(píng)價(jià)，對(duì)保健食品的開發(fā)具有積極作用。由此可見，松杉靈芝在抗氧化、抗衰老等方面有較大的可挖掘潛能。

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