蘇玉嚴，周海妹，展學(xué)孔，陳文平（.海南省農(nóng)墾總局醫(yī)院藥劑科，?？谑?703；.海南全星醫(yī)藥研究院，?？谑?5706）

夏天無薄膜衣片為夏天無經(jīng)加工制成的片劑，其功效為活血通絡(luò)、行氣止痛。臨床上用于瘀血阻絡(luò)、氣行不暢所致的中風(fēng)，癥見半身不遂、偏身麻木，或跌撲損傷、氣血瘀阻所致的肢體疼痛、腫脹麻木；風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、坐骨神經(jīng)痛見上述證候者[1]。由于夏天無片在1994～2008年處于中藥保護品種保護范圍之內(nèi)，所以到目前為止，尚無采用高效液相色譜（HPLC）法對夏天無薄膜衣片含量進行測定的文獻報道。為此，本試驗通過建立HPLC法對該藥的指標(biāo)性成分進行含量測定，從而為夏天無薄膜衣片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

HPLC色譜儀，配備SPD-10Avp紫外檢測器、LC-10Atvp泵（日本島津公司）；色譜柱（天津天和公司）；2010色譜工作站（浙江大學(xué)智能信息工程研究所）；紫外-可見分光光度計（日本島津公司，型號：UV-2450）；BS 124S萬分之一電子分析天平（德國賽多利斯北京有限公司）；超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司，型號：SK-2500，功率：53 kHz）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司，型號：HH-4）等。

1.2 試藥

原阿片堿標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110853-200402）；夏天無薄膜衣片供試品（海南全星藥物研究院制劑室，批號：20090301、20090302、20090303，規(guī)格：每片重0.3 g）。乙腈、三乙胺、甲醇均為色譜純，水為注射用水，鹽酸、冰醋酸均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250 mm×460 mm，5 μm）；柱溫：30℃；進樣量：20μL；流動相：乙腈-三乙胺醋酸溶液（取三乙胺8 mL，冰醋酸30 mL，加水稀釋至1 000 mL，18∶82）；流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：289 nm。理論塔板數(shù)按原阿片堿計算≥3 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱取原阿片堿標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg，置于50 mL容量瓶中，用1%鹽酸5 mL溶解，加入50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置于25 mL量瓶中，加入50%甲醇至刻度，搖勻，即得濃度為40μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。

2.2.2 供試品溶液的制備：取本品10片，除去薄膜包衣，精密稱定，研細，稱取樣品0.6 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%的甲醇50 mL，稱重，加熱回流1 h，放冷，再稱重，用50%的甲醇補足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 專屬性試驗

精密吸取50%甲醇溶液（溶劑空白）、標(biāo)準(zhǔn)品溶液及供試品溶液各20μL，按“2.1”項下色譜條件分別注入HPLC儀。結(jié)果，原阿片堿的色譜峰保留時間適宜，且供試品溶液中主峰與其余各峰分離效果較好。色譜見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

圖1 高效液相色譜圖A.溶劑空白；B.標(biāo)準(zhǔn)品；C.供試品Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank solvent；B.reference substance；C.test sample

精密吸取“2.2.1”項下標(biāo)準(zhǔn)品貯備液1、3、5、7、9 mL，分別置于50 mL容量瓶中，加入50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為8.48、25.44、42.40、59.36、76.32 μg·mL－1的系列溶液，按“2.1”項下色譜條件分別進樣測定。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝7 505 4X－2 052 0（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，夏天無薄膜衣片中原阿片堿的質(zhì)量濃度在8.48～76.32μg·mL－1的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。線性關(guān)系試驗結(jié)果詳見圖2。

圖2 夏天無薄膜衣片中原阿片堿的含量測定線性回歸圖Fig 2 Linear regression of content determination of protopine in C.decumbens film-coated tablets

2.5 精密度試驗

取“2.2.1”項下方法制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣，重復(fù)測量6次。結(jié)果，RSD＝0.63%（n＝6），表明儀器精密度良好，詳見表1。

表1 精密度試驗結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of precision test（n＝6）

2.6 穩(wěn)定性試驗

按“2.2.2”項下方法配制供試品溶液1份適量，室溫放置，按“2.1”項下色譜條件分別于0、2、4、6、8 h進樣測量。結(jié)果RSD＝0.73%，表明供試品溶液在1個工作日內(nèi)穩(wěn)定，詳見表2。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一批樣品（批號：20090301）6份，精密稱定，分別為0.601 2 g、0.601 8 g、0.601 3 g、0.600 9 g、0.602 1 g、0.601 0 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，各取20μL進行測定。結(jié)果RSD＝1.25%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好，詳見表3。

表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果（n＝5）Tab 2 Results of stability test（n＝5）

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果（n＝6）Tab 3 Results of repeatable test（n＝6）

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品13.3 mg，置于25 mL容量瓶中，制備濃度為0.532 mg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。采用加樣回收法，精密稱取已測定含量（3.504 mg·g－1）的同一批號樣品6份，每份0.3 g（0.302 5 g、0.298 8 g、0.300 4 g、0.302 6 g、0.299 6 g、0.301 2 g），分別加入濃度為0.532 mg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液2 mL和50%的甲醇50 mL，依“2.2.2”項下方法進行溶液制備，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液及供試品溶液各20μL進行測定，計算回收率。結(jié)果，原阿片堿的平均回收率為99.39%，RSD＝0.92%（n＝6），詳見表4。

表4 加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）Tab 4 Results of recovery test（n＝6）

2.9 樣品含量測定

取本品3個批號（20090301、20090302、20090303；規(guī)格：每片0.3 g），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，各取20μL進行含量測定，結(jié)果見表5。

表5 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 5 Results of content determination（n＝3）

3 討論

3.1 含量測定方法的選擇

由于夏天無薄膜衣片的樣品處理方法比較簡單，僅是采用加熱回流的方法進行提取，所以本文在選擇該樣品內(nèi)原阿片堿含量測定方法時，優(yōu)先考慮采用簡單易行的外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法，并對該方法進行系統(tǒng)適用性試驗及含量測定方法學(xué)考察。結(jié)果，采用本法測定夏天無薄膜衣片中原阿片堿含量時，其它成分干擾較少、分離度佳、回收率高、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，符合國家對藥品含量測定的要求。此外，在含量測定過程中，筆者采用定量環(huán)進樣，這樣不僅克服了外標(biāo)法對進樣量要求精確之難題，同時也避免了使用內(nèi)標(biāo)法尋找內(nèi)標(biāo)物的困難和操作步驟煩瑣所帶來的誤差。

3.2 檢測波長的選擇

由于不同的文獻報道對原阿片堿測定所采用的波長不一樣，為確定試驗中最終的檢測波長，本文通過利用原阿片堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液采用紫外分光光度法（《中國藥典》（2005年版）附錄ⅤA）測定，在波長200～400 nm范圍內(nèi)掃描，掃描圖譜顯示，原阿片堿在240、289 nm波長處有較強吸收。故根據(jù)實驗結(jié)果并結(jié)合有關(guān)文獻[2，3]報道，最終選擇289 nm為本品的檢測波長。

3.3 樣品處理時間的選擇

在供試品的處理當(dāng)中，本文采用水浴回流的提取方法，并對回流提取的時間進行了考察。取同批等量樣品3份，分別加熱回流法提取45、60、75 min，得樣品溶液。各取樣品溶液20μL注入HPLC儀進行測定。含量測定結(jié)果表明，除了回流法提取45 min的樣品含量較低之外，60 min與75 min時樣品的含量無明顯差異。綜合考慮，最終選擇樣品的回流法提取時間為60 min。

綜上所述，本研究建立了HPLC法測定夏天無薄膜衣片中原阿片堿含量的方法，該法簡單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于夏天無薄膜衣片的質(zhì)量控制。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：196.

[2]潘成學(xué)，劉 偉，申小靜.HPLC測定夏天無膠囊中原阿片堿的含量[J].鄭州大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2005，40（4）：722.

[3]李向陽，屠萬倩.HPLC測定夏天無膠囊中原阿片堿的含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2005，16（4）：272.