張 禹,潘曉雯*,周 山,潘樹義,胡慧軍,高春錦,劉福佳

(1海軍總醫(yī)院,北京 100048;2首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院)

神經(jīng)生長因子(NGF)是重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子,對維持中樞系統(tǒng)神經(jīng)元功能有重要作用[1]。在臨床中應用高壓氧(HBO)治療顱腦損傷已得到廣泛推廣,并取得了較好療效。2008年 11月 ～2009年3月,我們研究 HBO對腦損傷大鼠及健康大鼠腦內(nèi)NGF表達的影響,同時探討了單純高氣壓環(huán)境對NGF表達的影響,比較其與 HBO的差異,為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性健康 Wistar大鼠 48只,體質(zhì)量 230～270 g,由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。

1.2 主要儀器和試劑 DWC150-300型透明純氧動物實驗艙(上海 701所楊園醫(yī)用氧艙廠制造);HPD-1700型液壓撞擊儀,TDS1002數(shù)字存儲示波器(美國 DRAGONFLY研究與發(fā)展公司);微型磨鉆(韓國生產(chǎn));NGF兔抗多克隆抗體(武漢博士德生物技術(shù)有限公司);醫(yī)用氧氣及合成空氣(北京普萊克斯實用氣體有限公司)。

1.3 動物模型制備 應用液壓撞擊儀制作側(cè)位液壓沖擊腦損傷大鼠模型。用 10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉(麻醉劑量為 0.3 ml/100 g),麻醉后將大鼠俯臥位固定于手術(shù)板上,無菌條件下切開左側(cè)顱頂皮膚暴露顱骨,用微型磨鉆于左頂骨鉆孔,距離冠狀縫 3 mm,矢狀縫 2 mm,鉆孔直徑約 2 mm,保持硬腦膜完整。將液壓撞擊儀注滿蒸餾水,調(diào)整沖擊力度,使其在數(shù)字存儲示波器上顯示波峰為 1.5 V(0.3 MPa),該沖擊壓可使大鼠造成重度腦損傷。用塑料連接器連接撞擊儀出水管與大鼠鉆孔處,開動開關(guān)用蒸餾水沖擊大鼠硬腦膜造成閉合性腦損傷,重復打擊 3次。完成后骨蠟封閉鉆孔縫合切口。

1.4 分組及處理方法 將 48只大鼠隨機分成腦損傷組及正常對照組,每組 24只。腦損傷組均應用液壓撞擊儀制備腦損傷模型,再隨機分成 3組,每組 8只。第 1組進行 HBO暴露:創(chuàng)傷 24 h后將大鼠置于動物實驗艙內(nèi),純氧洗艙 5 min,升壓 5 min至0.25 MPa,穩(wěn)壓吸氧 45 min,減壓 10 min。持續(xù)通風,氧流量維持在 1 L/min,艙內(nèi)氧濃度維持在 95%以上。連續(xù) 5 d,1次/d。第 2組進行高壓空氣(HBA)暴露:創(chuàng)傷 24 h后將大鼠置于動物實驗艙內(nèi),升壓 5 min至 0.25 MPa,穩(wěn)壓 45 min,減壓 10 min。持續(xù)通風,空氣流量維持在 1 L/min。連續(xù) 5 d,1次/d。第 3組進行常壓空氣暴露:創(chuàng)傷后放置常溫常壓室內(nèi)飼養(yǎng),自由進食水,飼養(yǎng)時間與上述兩組相同。正常對照組不進行模型制備,分 3組,每組8只,分別進行 HBO、HBA及常壓空氣暴露,具體暴露方法與腦損傷組相同。

1.5 NGF表達檢測 所有動物在完成暴露后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,仰臥位固定于手術(shù)臺上,開放腹腔,夾閉腹主動脈,打開胸腔,剪斷肋骨,灌注針頭插入心尖部,止血鉗鉗夾固定,依次以生理鹽水 250 ml、4%多聚甲醛 PBS溶液 200 ml心臟灌注,可見大鼠雙上肢及雙眼球顏色轉(zhuǎn)為蒼白。斷頭取腦,取左側(cè)大腦半球放入 4%多聚甲醛 PBS溶液固定。創(chuàng)傷組肉眼可見鉆孔沖擊處左頂葉凹陷性損傷,沿凹陷前后沿行冠狀切開,正常對照組大鼠于同樣平行位置冠狀開,留取中間腦組織按常規(guī)脫水、媒染、浸蠟,最后將組織塊包埋制成蠟塊,石蠟切片機連續(xù)切片,厚度 5μm。行常規(guī) HE染色及 NGF免疫組織化學染色。

1.6 結(jié)果分析 在 200倍光鏡視野下,結(jié)合 HE染色切片,分別對各組切片的 NGF免疫組織化學染色陽性細胞進行計數(shù),計數(shù)區(qū)域為大腦皮層區(qū),計數(shù) 5個視野,最后取平均值,以個/視野來表示。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計分析,計數(shù)細胞用ˉx±s表示,組間比較采用t檢驗,以 P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腦損傷大鼠模型 在液壓沖擊的同時可見大鼠出現(xiàn)呼吸暫停,持續(xù) 3～5 s,四肢軟癱?？p合后 2～6 h陸續(xù)轉(zhuǎn)醒,醒后可正常進食水,活動減少,未見肢體偏癱等神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)。斷頭取腦后肉眼可見部分腦創(chuàng)傷組大鼠腦表面溝回積血,符合蛛網(wǎng)膜下腔出血表現(xiàn),局部硬膜下出血、腦實質(zhì)出血及腦挫裂傷。

2.2 HE染色 光鏡下,正常對照組大鼠神經(jīng)元胞體呈圓形或橢圓形,形態(tài)正常,核膜完整,核仁清晰可見;腦損傷組各組損傷區(qū)域均可見神經(jīng)元細胞胞體固縮、深染、拉長,或呈三角形,核膜不清,核仁不清,各組變性神經(jīng)元數(shù)無明顯差異。

2.3 免疫組織化學染色 光鏡下 NGF免疫陽性細胞表現(xiàn)為神經(jīng)元的胞膜、胞質(zhì)、軸突及樹突均可見的棕褐色陽性顆粒。兩組 NGF免疫陽性細胞數(shù)見表 1。

表 1 兩組 NGF免疫陽性細胞數(shù)(ˉx±s)

3 討論

NGF在腦損傷后可以促進神經(jīng)細胞的修復,同時促進軸突生長以促進神經(jīng)元環(huán)路的重建[2,3]。由于神經(jīng)細胞的遷移是腦損傷后神經(jīng)干細胞參與腦修復的重要過程,我們認為 NGF對腦損傷后神經(jīng)干細胞的遷移也產(chǎn)生重要的作用[4]。由于外源性 NGF不易透過血腦屏障,所以促進內(nèi)源性 NGF的分泌,提高內(nèi)源性 NGF的表達是腦損傷后促進神經(jīng)細胞修復的重要手段。

國內(nèi)外廣泛應用 HBO治療顱腦損傷,取得了顯著的臨床療效,其可促醒、減少外傷后并發(fā)癥、促進神經(jīng)功能恢復。HBO治療的目的是阻斷腦缺血—腦水腫—顱內(nèi)高壓的惡性循環(huán)。已經(jīng)明確的 HBO機制包括:①HBO可以使大腦中動脈系統(tǒng)收縮,血流量減少,血氧含量增加,能在腦血流量減少的情況下改善供氧,降低顱內(nèi)壓,減輕腦水腫。②抑制炎癥反應和自由基的作用。常規(guī) HBO治療可減少體內(nèi)自由基,降低血清脂質(zhì)過氧化物含量,從而對缺血缺氧的神經(jīng)元起到保護作用。③HBO能使鈣泵功能恢復減輕鈣超載,腦水腫減輕,減少 TXA2產(chǎn)生。

本研究發(fā)現(xiàn),腦損傷 HBO暴露組 NGF免疫陽性細胞數(shù)量多于腦損傷 HBA及常壓空氣暴露組,故可以肯定是 HBO對 NGF的高水平表達起到了一定的作用,而非 HBA所致;HBO對正常腦組織 NGF的表達無增強作用,但是對損傷后腦組織的 NGF表達有明顯增強作用,從而促進神經(jīng)細胞的恢復[5]。有研究發(fā)現(xiàn)[6],腦損傷后可以誘導 c-fos基因的表達,并在繼發(fā)性反應中具有重要的調(diào)節(jié)作用,后者通過構(gòu)成 AP-1轉(zhuǎn)錄因子,對其下游基因的表達進行調(diào)控,其中 NGF就是一個非常重要的靶基因。HBO是否通過某些機制參與到上述調(diào)控過程,從而促進NGF的表達,有待進一步研究。

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