張 萍，張 莉，于燕莉

肌苷氯化鈉注射液屬輔酶類藥,具有改善機體代謝的作用。臨床用于各種類型的肝臟疾患、心臟疾患、白細胞減少癥、血小板減少癥、中心視網(wǎng)膜炎、視神經(jīng)萎縮等。中華人民共和國國家藥品監(jiān)督管理局標準規(guī)定其熱原檢查為家兔法[1]，用鱟試劑檢查肌苷氯化鈉注射液細菌內毒素目前尚未見報道。為了提高其熱原檢查的快速性，有效性和靈敏度，本文參照中國藥典2005年版中細菌內毒素檢查法中的有關規(guī)定及相關文獻，對該品種進行了細菌內毒素的檢查法的可行性研究，報告如下。

1 實驗材料

1.1 試劑 細菌內毒素工作標準品（CSE，中國生物制品檢定所，70 EU/ml，批號 070121）。 鱟試劑（TAL，廈門鱟試劑廠，

批號 080120，標示靈敏度 0.25 EU/ml，0.1 ml/支；湛江海洋生物制品廠，批號 080319，靈敏度 0.25 EU/ml，0.1 ml/支）。 細菌內毒素檢查用水（BET水，湛江海洋生物制品廠，批號070914，2 ml/支，內毒素含量＜0.03 EU/ml；肌苷氯化鈉注射液500 mg/100 ml（山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司批號：20070407，20070612，20070918）。

1.2 實驗材料、器皿 自動旋渦混合器：天津藥典標準儀器廠；DC-3型干式恒溫器：南京三愛斯技術有限開發(fā)公司；試管、吸管等所需器皿均經(jīng)250℃ 1h除去外源性內毒素。

2 方法與結果

2.1 TAL靈敏度復核試驗 按中國藥典2000年版附錄細菌內毒素檢查法[1]進行操作，復核靈敏度 λc為 0.5～2.0 λ，表明試驗用二個生產(chǎn)廠家的二批鱟試劑靈敏度標示符合規(guī)定。結果見表1。

2.2 供試品的干擾初篩試驗

2.2.1 供試品細菌內毒素理論限值（L）的確立[1]按公式L=K/M，內毒素致熱閾K為按規(guī)定的給藥途徑，人用kg體重每h最大可接受的細菌內毒素劑量，注射劑K值為5 EU/kg·h；M為人用每kg體重每h的最大劑量，人增體重按60 kg計算。根據(jù)肌苷氯化鈉注射液最大劑量為100 ml/60 kg·h，則細菌內毒素理論限值：L=K/M=5/（100/60）=3.0 EU/ml。

2.2.2 樣品最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確立[1]按公式MVD=CL/λ 計算，則 MVD=1×3/0.25=12（倍）。

2.2.3 預干擾試驗[2]用BET水分別將供試品溶液按照原液→1∶2→1∶4稀釋。同時，用此系列濃度的樣品溶液稀釋細胞內毒素分別取不同稀釋度的供試品溶液將70 EU/mlCSE按 70 EU/ml→10 EU/ml→1.0 EU/ml，→0.5 EU/ml，→0.25 EU/ml→0.125 EU/ml→0.0625 EU/ml進行稀釋，配制成含有不同稀釋濃度樣品的相應內毒素管。取內毒素含量為0.5 EU/ml，0.0625 EU/ml各稀釋濃度的上述溶液各0.1 ml，分別加入已復溶的0.1 ml TAL安瓿中，進行預試驗，每一濃度平行做2管；另取0.1 ml內毒素檢查用水加入已復溶的0.1 mlTAL安瓿中，作陰性對照，恒溫（37±1） ℃，保溫（60±2）min。 由表2的結果表明：原液2 λ全為陽性，1/4 λ全為陰性，陰性對照（NC）為陰性，陽性對照(PC)為陽性。說明注射液原液對鱟試劑反應無干擾，不需稀釋即可作為正式試驗的樣品[3]。

表1 鱟試劑的靈敏度復核試驗

表2 肌苷氯化鈉注射液預干預試驗結果

2.3 干擾試驗 預試驗表明，樣品原溶液對細菌內毒不存在抑制或增敏作用，樣品不需稀釋即可用于試驗，但仍需進一步作干擾驗證。將三批批號的肌苷氯化鈉原液將70 EU/ml的CSE 稀釋制得 0.5、0.25、0.125、0.0625 EU/ml系列內毒素濃度溶液，各取0.1 ml加入0.1 ml BET水復溶的TAL安瓿中，每一濃度平行做4管。另取0.1 ml細菌內毒素檢查用水和樣品原液加入上述CSE安瓿中，各平行做2管，作為陰性對照，恒溫（37±1） ℃，保溫（60±2） min，觀察結果。

2.4 結果 依據(jù)中國藥典2005年版規(guī)定：用BET水制成的內毒素標準溶液的反應終點濃度幾何平均值Es和用供試品溶液制成的內毒素標準溶液的反應終點濃度幾何平均值Et。

Xs、Xt分別為BET水和供試品溶液制成的內毒素溶液的反應終點濃度的對數(shù)值。

當 Es 值在 0.5～2.0 λ，Et在 0.5～2.0 Es，可以認為供試品溶液在該濃度下對TAL不存在干擾。根據(jù)表3、4試驗數(shù)據(jù)說明三批肌苷氯化鈉注射液在不需要稀釋的情況下，對細菌內毒素檢測均無干擾，在進行該品種的細菌內毒素檢查時可選用的鱟試劑靈敏度為0.25 EU/ml。計算結果見表5。

表3 肌苷氯化鈉注射液干預試驗結果

表4 肌苷氯化鈉注射液干預試驗結果

表5 干擾試驗計算結果

3 討 論

本實驗采用3個批號的肌苷氯化鈉注射液分別用兩個不同廠家的鱟試劑進行干擾試驗。結果顯示樣品原液對鱟試劑不存在干擾作用。以上三批樣品，均經(jīng)熱原檢測（家兔法）合格，同時，用細菌內毒素檢查法，樣品不需稀釋，鱟試劑靈敏度為0.25EU/ml時測定結果為陰性，干擾試驗結果符合要求。說明用細菌內毒素檢查法可替代熱原檢查法。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）.北京:化學工業(yè)出版社,2005.附錄 P86,204.

[2]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2001.389.

[3]黃清泉,夏振民.藥品細菌內毒素檢查的實驗設計.中國藥學雜志,1997,32(2)：72.

[4]中華人民共和國國家藥品監(jiān)督管理局.國家藥品標準.WS-1061(X-796)-2002.