馬慶芳，張介馳，張丕奇，劉佳寧，孔祥輝，韓增華，戴肖東

（黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江 哈爾濱150010）

黑木耳屬異宗結(jié)合單因子控制的二極性的菌類［1］。菌種選育是改造菌種，提高生物學(xué)效率的一項(xiàng)重要措施，單核體雜交育種是食用菌優(yōu)良菌株選育較為常用而有效的育種方法。如何快速準(zhǔn)確地確認(rèn)單核菌株的交配型對育種研究有著十分重要的意義。而且真菌自然群體中交配型因子的研究可以加深相關(guān)遺傳背景的了解，為菌種鑒定提供一個良好的參考標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

黑木耳(Auricularia auricular)“黑29”，由黑龍江省科學(xué)院應(yīng)用微生物研究所提供。采用原生質(zhì)體再生法獲黑木耳“黑29”單核菌株100多株，經(jīng)過表觀形態(tài)觀察、對峙試驗(yàn)選出18株單核菌株，分別命名為 ：29-1、29-2、29-3、29-4、29-5、29-6、29-7、29-8、29-9、29-10、29-11、29-12、29-13、29-14、29-15、29-16、29-17、29-18，用于其他試驗(yàn)確認(rèn)單核菌株交配型。

1.1.2 試劑

0.1mol/L pH 6.4的磷酸鹽緩沖液，TBE緩沖液0.09mol/L，Tris-硼酸，0.002mol/L EDTA。

1.1.3 培養(yǎng)基

cPDA母種培養(yǎng)基，OGF液體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 菌絲表觀形態(tài)觀察

將“黑29”原生質(zhì)體再生菌株轉(zhuǎn)接于cPDA母種培養(yǎng)基進(jìn)行插片培養(yǎng)，待菌絲長至載玻片上后進(jìn)行熒光檢測［2-3］。將熒光檢測確認(rèn)為單核的“黑29”菌株重新轉(zhuǎn)接于cPDA平板上，觀察菌絲生長情況［4］。

1.2.2 酯酶同工酶技術(shù)檢測“黑29”單核菌株交配型

用OGF培養(yǎng)基，供試菌株靜止培養(yǎng)15d，過濾收集菌絲2～3g，-20℃下冷凍16h。冰浴研磨成糊狀，低溫12000rpm離心30min，冷凍備用。用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度7.5%，濃縮膠濃度2.5%。電極緩沖液Tris-Glycine系統(tǒng)，pH8.3。溴酚蘭作指示劑，4℃電泳。濃縮膠電壓為120V，分離膠電壓為220V，電泳4.0h左右，指示劑距前沿線1.0cm時(shí)取下凝膠，用醋酸-α-萘酯和堅(jiān)牢蘭染色［5］。

1.2.3 黑木耳單核菌株回交試驗(yàn)檢測其交配型

將已選出的單核菌株29-7與29-7、29-1、29-4、29-11、29-16兩兩配對，分別接入cPDA平板培養(yǎng)基中，菌株間距1.0cm，25℃恒溫培養(yǎng)，7～10d后觀察不同菌株菌絲交匯后的生長情況。取兩菌株中間交匯處的菌絲進(jìn)行純培養(yǎng)，做常規(guī)出耳試驗(yàn)［6］。配對組合編號1號：29-7與 29-1；2號：29-7與 29-4；3號：29-7與29-11；4 號：29-7與 29-7；5號：29-7與 29-16。觀察栽培過程中袋內(nèi)菌絲生長情況、現(xiàn)耳芽情況和出耳情況，確認(rèn)“黑29”單核菌株交配型。

2 結(jié)果與分析

2.1 “黑29”單核菌株表觀形態(tài)觀察

圖1 “黑29”單核菌株菌絲生長形態(tài)Fig.1“Hei 29”hypha growth morphology of mononuclear strain

在cPDA培養(yǎng)基上，“黑29”單雙核菌株菌絲形態(tài)、生長速度、色素產(chǎn)生情況差異都很大?！昂?9”雙核菌株菌絲粗壯，氣生菌絲濃密，長速塊。29-7氣生菌絲發(fā)達(dá)，菌絲非常纖細(xì)潔白，菌絲生長速度最快，無色素產(chǎn)生 ；其 余 單 核 菌 株（29-1、29-2、29-3、29-4、29-5、29-6、29-8、29-9、29-10、29-11、29-12、29-13、29-15、29-16、29-17、29-18）菌絲生長速度慢，菌絲長勢非常弱，氣生菌絲少，培養(yǎng)后期菌絲停止生長，生長過程中色素分泌多（圖1、表1）。由表觀形態(tài)可初步將18個“黑29”單核菌株分成兩組，第一組包括29-7，是一種交配型；第二組包括：29-1、29-2、29-3、29-4、29-5、29-6、29-8、29-9、29-10、29-11、29-12、29-13、29-14、29-15、29-16、29-17、29-18 十七個菌株，是另外一種交配型。

表1 單核菌株菌絲生長形態(tài)Table 1 Hypha growth morphologyofmononuclear strain

2.2 酯酶同工酶技術(shù)檢測“黑29”單核菌株交配型

圖2 “黑29”單核菌株酯酶同工酶電泳圖譜Fig.2 Isodynamic lipoidase electrophoresis map of mononuclear strain

通過酯酶同工酶電泳檢測（見圖2），可知培養(yǎng)15d“黑29”雙核菌株酯酶同工酶酶帶間界限不清，超過了最佳培養(yǎng)時(shí)期。所有單核菌株酯酶同工酶酶帶清晰，分辨效果好，所有“黑29”單核菌株只有兩種同功酶形態(tài)?！昂?9”供試的單核菌株有三條共有酶帶Rf2、Rf6、Rf7。單核菌株 29-1、29-2、29-3、29-4、29-6、29-8、29-11、29-12、29-13、29-15、29-16、29-17、29-18酯酶同工酶譜帶完全一致，屬于一種交配型；單核菌株29-7酯酶同工酶譜帶與其他單核菌株有很大差異（見圖 2、表2、表 3），29-7與其他單核菌相比，缺少Rf1、Rf3、Rf5、Rf8四條譜帶，比其又多出Rf4、Rf9兩條譜帶?？梢耘卸ǎ?9-7單核菌株是另一種交配型，這一結(jié)果與表觀形態(tài)觀察結(jié)果一致。

表2 “黑29”單核菌株酯酶同工酶譜Rf值Table 2“Hei 29”Rf value of isodynamic lipoidase electrophoresis

表3 “黑29”單核菌株酯酶同工酶譜Rf值Table 3“Hei 29”Rfvalue ofisodynamic lipoidase electrophoresis

2.3 “黑29”單核菌株回交試驗(yàn)檢測黑木耳單核菌株的交配型

從18個單核菌中選29-7與29-1、29-4、29-11、29-16兩兩配對接種于cPDA平板。如果兩菌株是屬于不同交配型，兩菌株相互親和，菌絲交匯后應(yīng)該產(chǎn)生雙核菌株，菌絲生長情況應(yīng)有所變化；如果兩菌株是屬于同一交配型，兩菌株間不親和，菌絲交匯后生長無變化。

29-7 與 29-1、29-4、29-11、29-16 兩兩配對接種于cPDA平板，25℃下恒溫培養(yǎng)，菌絲交匯后，菌絲生長有明顯變化：菌絲比單核菌株變粗壯濃密、生長速度加快（見圖5、圖6）。而29-7與29-7交匯后菌絲細(xì)弱，生長無變化（見圖 3）。29-1、29-4、29-11、29-16四個單核菌株之間兩兩配對后，菌絲交匯后生長無明顯變化，菌絲生長不舒展，生長速度慢，后期停止生長（見圖4）。說明 29-7與 29-1、29-4、29-11、29-16單核菌株交匯后形成了雙核菌株，29-7與29-1、29-4、29-11、29-16不屬于同一種交配型，兩單核菌株親和形成了雙核菌株。而29-7與29-7之間、29-1、29-4、29-11、29-16四單核菌絲之間，兩兩配對生長交匯后未形成雙核菌株，屬于同一種交配型，兩菌株之間不親和。

圖3 29-7＋29-7回交試驗(yàn)Fig.3 Backcross test of 29-7＋29-7

圖4 29-11＋29-16回交試驗(yàn)Fig.4 Backcross test of 29-11＋29-16

圖5 29-7＋29-16回交試驗(yàn)Fig.5 Backcross test of 29-7＋29-16

圖629 -7＋29-11回交試驗(yàn)Fig.6 Backcross test of 29-7＋29-11

2.4 “黑29”單核菌株回交栽培出耳試驗(yàn)

菌絲培養(yǎng)階段（見圖 7）：取 29-7與 29-1、29-4、29-11、29-7、29-16兩兩菌株交匯中間部位菌絲重新培養(yǎng)進(jìn)行常規(guī)出耳試驗(yàn)，接種栽培袋后，培養(yǎng)階段，4號（29-7與29-7回交后菌株）萌發(fā)慢，長勢弱，吃料慢；29-11與29-16回交后交匯處菌絲接入栽培袋未萌發(fā)未吃料?，F(xiàn)耳芽階段：4號無耳芽出現(xiàn)，沒結(jié)實(shí)。說明配對菌株生長交匯后不親和，未形成雙核菌株。而29-7與 29-1、29-4、29-11、29-16回交后菌株（1號、2號、3號和5號）在菌絲培養(yǎng)階段，菌絲萌發(fā)正常，長勢好，吃料快；現(xiàn)耳芽階段：1號、2號、3號、5號均有耳芽產(chǎn)生；出耳階段：1號、2號、3號、5號產(chǎn)生了子實(shí)體（見圖8）。說明配對菌株生長交匯后親和，形成雙核菌株。證實(shí) 29-7 與 29-1、29-4、29-11、29-16 不屬于一個交配型。

圖7 菌絲培養(yǎng)階段回交菌株生長情況Fig.7 Hypha growth morphology of backcross

圖8 出耳階段回交菌株出耳情況Fig.8 Shooting of backcross strain strain

3 討 論

用纖維素酶制得黑木耳“黑29”原生質(zhì)體，通過原生質(zhì)體再生獲得單核菌株，經(jīng)熒光顯微鏡檢確認(rèn)“黑29”單核菌株100多株。制備的原生質(zhì)體兩個核的再生能力差異很大，獲得的100多個單核菌株中有2個菌株屬于一種交配型（29-7），其余菌株均屬于另一種交配型。“黑29”不同交配型的單核菌株菌絲生長勢、菌絲生長速度、色素產(chǎn)生情況有著明顯的差異，黑木耳其他菌株的情況是否如此，有待于進(jìn)一步研究。

［1］楊新美.中國食用菌栽培學(xué)［M］.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1988:150-151.

［2］楊新美.食用菌研究法［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998:5-8.

［3］羅信昌，陳大年.食用菌核熒光染色技術(shù)的研究［J］.真菌學(xué)報(bào)，1990，9（1）：64-68.

［4］何培新，申進(jìn)文，羅信昌，等.木耳孢子單核菌株培養(yǎng)性狀多態(tài)性研究［J］.食用菌學(xué)報(bào)，2003，10（2）：1-4.

［5］韓增華，張介馳，戴肖東，等.黑木耳液體菌絲球長期保藏菌種性狀研究［J］.食用菌，2007，29（1）：21-22.

［6］孔祥輝，王玉江，張丕奇.北方代料栽培黑木耳與猴頭的關(guān)鍵技術(shù)［M］.哈爾濱：黑龍江科學(xué)技術(shù)出版社，2005:1-117.