李 斌，董明盛*

(南京農業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095)

細菌生物膜是指由附著于惰性或者活性實體表面的細菌細胞和包裹著細菌的水合性基質所組成的結構性細菌群落[1]。現(xiàn)已證明，很多久治不愈的慢性細菌性感染與生物膜有關。細菌可在人體組織如牙齒、皮膚、肺、尿道及其他器官的表面形成生物膜，引起諸如肺囊性纖維化、彌漫性泛細支氣管炎、牙周炎、膽道感染、心瓣膜性心內膜炎等[2-3]。細菌能黏附在大多數(shù)醫(yī)療器械的材料表面并形成生物膜，如靜脈導管、導尿管、氣管插管、人工心臟瓣膜、隱型眼鏡等[4-5]。此外，生物膜細菌還可污染與人類生活相關的供水系統(tǒng)、空調系統(tǒng)和食品加工設備等，由此造成傳染病的流行[6-7]。據(jù)估計，大約65%人類細菌性感染是由生物膜細菌引起的。因此如何抑制生物膜形成引起了學者們的廣泛關注。

黑木耳(Auricularia auricula)隸屬真菌門、擔子菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬，是著名藥食兼用真菌。子實體除含有豐富的蛋白質、纖維素等營養(yǎng)物質外，還含有豐富的B族維生素以及鈣、磷、銅等有益元素。黑木耳多糖還具有抗腫瘤、抗血栓、抗衰老、降血糖、降血脂、調節(jié)免疫等功能[8]。從木耳子實體中分離的黑刺菌素(adustin)有抗真菌作用。深入研究黑木耳的主要活性功能成分，探索其對人類的有益作用，具有重要的現(xiàn)實意義。我國是世界上主要的黑木耳生產國，其人工栽培起源于我國，年產量占世界總產量的90%以上。黑木耳在我國多數(shù)地區(qū)都有生產，據(jù)記載已有1000多年歷史。本實驗主要研究黑木耳提取物對大腸桿菌生物膜形成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳子實體(產地黑龍江綏陽) 市購。8-苯胺-1-萘磺酸 Sigma公司。

Escherichia.coli8099由本實驗室保存，在LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)。

LB培養(yǎng)基：NaCl 10g、胰蛋白胨10g、酵母粉5g、水1000mL，pH7.0。

1.2 儀器與設備

旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；卡爾加里生物膜裝置(Calgary biofilm device，CBD) 加拿大Innovotech公司；BIO-TEX ELX808全自動定量繪圖酶標儀 美國BIO-TEX公司；Nikon Eclipse 80i顯微鏡 日本尼康公司；Leica TCS SP2激光共聚焦顯微鏡 德國Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

黑木耳子實體經35℃恒溫烘干24h，粉碎，過40目篩，取10g粉末，加入乙酸乙酯40mL，靜置提取24h后，過濾除去殘渣，濾液經旋轉蒸發(fā)儀蒸干(真空度0.1Pa，溫度30℃)，再用2mL的甲醇重懸，重懸液經0.22μm的有機膜過濾除菌，黑木耳粗體物質量濃度為5g/mL，－20℃保藏，備用[9]。

1.3.2 粗提物對Escherichia.coli8099生物膜形成的影響

1.3.2.1 CBD板法,

該法參考的是1999年O Toole等[10]提出的方法。Escherichia.coli8099活化兩次后，按1%的比例接種新鮮的LB培養(yǎng)基，CBD板每個孔內加入2、4、6μL的黑木耳粗體物，對照為甲醇，每個樣品及對照做3個平行樣，37℃培養(yǎng)24h后，用蒸餾水清洗帶有小柱的上蓋3～5次；取另一個干凈的CBD板，加入125μL 0.3g/100mL結晶紫，將帶有小柱的上蓋蓋上染色15min，用蒸餾水清洗3～5次，去除多余的染料，再在另一個干凈的CBD板內加入200μL 95%乙醇溶解出結合于生物膜上的結晶紫，酶標儀測定OD595nm。

1.3.2.2 菌落計數(shù)法

通過計算生物膜中的活菌數(shù)對生物膜進行量化。為了將生物膜與其黏附的固體表面分離，通常使用一些機械方法，比如超聲或渦旋，得到的菌液常用平板菌落法，通過計算菌落形成單位(colony forming units，CFU)對生物膜內的活菌計數(shù)。該法參考Hentzer等[11]提出的方法。Escherichia.coli8099過夜培養(yǎng)后按2%的比例接種新鮮的LB培養(yǎng)基中，該稀釋液按一定量加入到已放有滅菌過的聚氯乙烯(PVC)小片的無菌試管中，加入黑木耳粗提物20、40、60μL，對照為甲醇，每個樣品及對照做3個平行對照，37℃培養(yǎng)24 h后，將PVC小片取出，用無菌的磷酸鹽緩沖液沖洗3～5次，以洗去游離細胞。然后將PVC小片放入磷酸鹽緩沖液中超聲20min，以使生物膜中的細胞脫落。最后將細胞懸浮液稀釋到合適濃度，涂布于固體的LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48h后計數(shù)。

1.3.2.3 光學顯微鏡實驗

E.coli8099活化兩次后，按1%的比例接種至新鮮的LB培養(yǎng)基中。在24孔板里放置10mm×10mm的玻片作為大腸桿菌生物膜黏附的載體，加入980μL上述菌液，再分別加入10、20μL甲醇和10、20μL黑木耳粗提物，空白對照為1mL上述菌液，37℃培養(yǎng)24h，用蒸餾水清洗3～5次，番紅簡單染色后于光學顯微鏡下觀察成膜情況。

1.3.2.4 激光共聚焦顯微鏡實驗

E.coli8099過夜培養(yǎng)后按5%的比例接種新鮮的LB培養(yǎng)基中，該稀釋液按一定量加入到已放有10mm×10mm玻片的24孔板里，加入黑木耳粗提物。37℃培養(yǎng)，每隔24h更新一次LB培養(yǎng)基，共培養(yǎng)3d。蒸餾水清洗3～5次，用0.1mol/L pH6.8磷酸緩沖液配成的1.25×10-3mol/L的熒光染料8-苯胺-1-萘磺酸溶液染色避光2h，激光共聚焦顯微鏡下觀察成膜情況，每塊玻片上隨機取3處測定生物膜厚度。

2 結果與分析

2.1 CBD板法

黑木耳粗體物對生物膜形成的影響結果見表1，未添加甲醇和黑木耳提取物的E.coli8099培養(yǎng)基的OD595nm是1.049±0.043。

表1 黑木耳粗提物對E.coli 8099生物膜形成的影響(CBD板法)Table1 Effect of Auricularia auricula extract on E.coli 8099 biofilm formation (CBD plate assay)

由表1可知，甲醇不抑制生物膜的形成。隨著黑木耳粗提物質量濃度的升高，對生物膜形成的抑制率也逐漸升高，當菌液中黑木耳粗提物的濃度達到0.3g/mL時，其對生物膜形成的抑制率達到73.00%。這種方法是一種傳統(tǒng)方法[12-13]，為了驗證實驗結果，本實驗同時采用了菌落計數(shù)法。

2.2 菌落計數(shù)法

該法通過直接計算生物膜內的活菌數(shù)對生物膜進行量化。未添加甲醇和黑木耳提取物的E.coli8099培養(yǎng)基的lg(CFU/chip)是6.358 ±0.003。

由表2可知，甲醇不抑制生物膜的形成。隨著黑木耳粗提物質量濃度的提高，其對E.coli8099生物膜形成的抑制能力也在逐漸提高。0.3g/mL的粗提物對生物膜的抑制率是71.63%。由于PVC小片和CBD的材料形狀不同，加上操作也不同，所以就同一菌株生物膜實驗得出結果有所差異應屬正常。

表2 黑木耳粗提物對E.coli 8099生物膜形成的影響(菌落計數(shù)法)Table2 Effect of Auricularia auricula extract on E.coli 8099 biofilm formation (colony count method)

2.3 光學顯微鏡實驗

將培養(yǎng)24h的大腸桿菌生物膜置于400倍光學顯微鏡下觀察，結果見圖1。

圖1 大腸桿菌生物膜鏡檢圖(×400)Fig.1 Microscopic image of E.coli biofilm (×400)

由圖1可知，添加了10μL甲醇的大腸桿菌在玻片上形成比較多的菌團單位，未添加任何試劑的菌團單位相對較少，而黑木耳粗提物質量濃度為0.1g/mL的大腸桿菌在玻片上幾乎不形成任何菌團單位。

2.4 激光共聚焦顯微鏡實驗

圖2 大腸桿菌生物膜三維結構(×630)Fig.2 3D structure of E.coli biofilm (×630)

將連續(xù)培養(yǎng)3d的大腸桿菌生物膜置于630倍激光共聚焦顯微鏡下觀察，結果見圖2。添加了10、20μL甲醇的大腸桿菌在玻片上形成較厚、有孔狀通道的成熟生物膜，添加了20μL甲醇的尤其密集，未添加任何試劑的生物膜相對減少，而黑木耳粗提物質量濃度為0.1、0.2g/mL的大腸桿菌在玻片上形成比較稀疏的菌團單位，黑木耳粗提物質量濃度為0.2g/mL的是碎片狀結構，這一結果同光學顯微鏡觀察的結果相同。形成的生物膜的厚度如表3所示。

表3 激光共聚焦顯微鏡實驗結果Table3 Thickness of E.coli biofilm examined with confocal laser scanning microscope

由表3可知，黑木耳粗提物質量濃度為0.1、0.2g/mL的大腸桿菌生物膜厚度相對于未添加任何試劑的大腸桿菌生物膜厚度分別減少了19.34%、50.40%，說明了黑木耳提取物可以明顯抑制大腸桿菌生物膜的形成，其抑制程度隨黑木耳粗提物質量濃度的增大而提高。

3 討 論

研究了黑木耳提取物對Escherichia coli8099生物膜的形成的影響，發(fā)現(xiàn)其明顯減弱了生物膜的形成，并且影響程度受黑木耳提取物質量濃度的影響，隨著質量濃度的增大，受抑制程度隨之提高。在我國，黑木耳作為一種食品和藥品已經有幾個世紀的歷史，黑木耳粗提物或者從中分離到的一些特殊化合物可能被人類用于研制控制或抑制有害生物膜形成的新型抑制劑。此外，為了能將黑木耳粗提物應用于食品領域，其成分以及成分結構需要進一步的研究，這也是本實驗室今后研究工作的重點。

[1] COSTERTON J W, LEWANDOWSKI Z, deBEER D, et al.Biofilms,the customized microniche[J].Journal of Bacteriology, 1994, 176(8):2137-2142.

[2] COSTERTON J W, STEWART P S, GREENBERG E P.Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections[J].Science, 1999, 284(5418): 1318-1322.

[3] PARSEK M R, SINGH P K.Bacterial biofilms: an emerging link todisease pathogenesis[J].Annu Rev Microbiol, 2003, 57: 677-701.

[4] COSTERTON J W, MONTANARO L, ARCIOLA C R.Biofilm in implant infections: its production and regulation[J].Int J Artif Organs,2005, 28(11): 1062-1068.

[5] SHIMIZU K, KOBAYAKAWA S, TSUJI A, et al.Biofilm formation on hydrophilic intraocular lens material[J].Curr Eye Res, 2006, 31(12):989-997.

[6] SIMOES M, PEREIRA M O, VIEIRA M J.Effect of mechanical stress on biofilms challenged by different chemicals[J].Water Res, 2005, 39(20): 5142-5152.

[7] van HOUDT R, AERTSEN A, JANSEN A, et al.Biofilm formation and cell-to-cell signalling in Gram-negative bacteria isolated from a food processing environment[J].J Appl Microbiol, 2004, 96(1): 177-184.

[8] 楊慶堯.食用菌生物學基礎[M].上海: 上海科學技術出版社, 1982:1-7.

[9] ADONIZIO A, KONG K F, MATHEE K.Inhibition of quorum sensingcontrolled virulence factor production inPseudomonas aeruginosaby South Florida plant extract[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,20,08, 52(1): 198-203.

[10] O'TOOLE G A, PRATT L A, WATNICK P I, et al.Genetic approaches to study of biofilms[J].Methods Enzymol, 1999, 310: 91-109.

[11] HENTZER M, TEITZEL G M, BALZER G J, et al.Alginate overproduction affectsPseudomonas aeruginosabiofilm structure and function[J].Journal of Bacteriology, 2001, 183(18): 5395-5401.

[12] XU Lin, LI Hualin, VUONG C, et al.Role of theluxSquorum-sensing system in biofilm formation and virulence ofStaphylococcus epidermidis[J].Infection and Immunity, 2006, 74(1): 488-496.

[13] GIRENNAVAR B, CEPEDA M L, SONI K A, et al.Grapefruit juice and its furocoumarins inhibits autoinducer signaling and biofilm formation in bacteria[J].Int J Food Microbiol, 2008, 125(2): 204-208.