劉 燦，生吉萍，鄒積華，王鴻磊，丁 強(qiáng)，申 琳,*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院，山東 煙臺(tái) 264067)

雙孢蘑菇[Agaricus bisporus(Large) Sing]是目前世界上人工栽培最廣泛、產(chǎn)量最高、消費(fèi)量最大的食用菌[1]。雙孢菇培養(yǎng)料發(fā)酵分為一次發(fā)酵和二次發(fā)酵，目前國(guó)內(nèi)外都以二次發(fā)酵為主，二次發(fā)酵的主流是采用發(fā)酵倉(cāng)系統(tǒng)模式進(jìn)行的[2]。機(jī)械化生產(chǎn)雙孢菇時(shí)，培養(yǎng)基發(fā)酵主要采用現(xiàn)在室外簡(jiǎn)易棚中進(jìn)行前發(fā)酵，然后在隧道中進(jìn)行后發(fā)酵，后發(fā)酵的隧道采用電腦自動(dòng)控制生產(chǎn)，控溫、控濕、控氣[3]。通過(guò)二次發(fā)酵，培養(yǎng)料中存在著復(fù)雜的生物降解作用，不同種類的微生物群落交替作用，結(jié)合各種化學(xué)反應(yīng)，使得培養(yǎng)料成為有利于蘑菇菌絲生長(zhǎng)的選擇性基質(zhì)[4]。

目前，對(duì)于培養(yǎng)料二次發(fā)酵過(guò)程是一個(gè)非人工加熱而自產(chǎn)熱過(guò)程，其中微生物交替及代謝起到非常重要的作用。前發(fā)酵過(guò)程中，一些中溫微生物首先利用原料中簡(jiǎn)單的有機(jī)質(zhì)，產(chǎn)生有機(jī)酸、CO2和熱量，使料溫上升，嗜熱微生物開(kāi)始代替中溫微生物，成為優(yōu)勢(shì)群落。在堆制前期料溫升至60℃以上時(shí)，細(xì)菌能大量繁殖，培養(yǎng)料中易揮發(fā)固體和大量簡(jiǎn)單的易被降解的糖由細(xì)菌分解掉[5]，這時(shí)很少分離到真菌[6]。在堆制后期，隨料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解轉(zhuǎn)化，料溫下降，許多嗜熱或耐熱放線菌及霉菌在此營(yíng)養(yǎng)和生態(tài)環(huán)境下開(kāi)始大量繁殖[7]。后發(fā)酵大致可以分為4個(gè)階段：平衡溫度、巴氏殺菌、空氣調(diào)節(jié)和冷卻[8]。一方面通過(guò)巴氏殺菌殺死病蟲(chóng)危害及其蟲(chóng)卵和一些有害的微生物及孢子，另一方面通過(guò)空氣調(diào)節(jié)促進(jìn)培養(yǎng)料進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為利于蘑菇菌絲吸收利用而競(jìng)爭(zhēng)性雜菌不易利用的選擇性培養(yǎng)料[9]。

針對(duì)雙孢菇培養(yǎng)料工廠化制備的二次發(fā)酵過(guò)程中，微生物自動(dòng)產(chǎn)熱，其中微生物及培養(yǎng)基理化性質(zhì)變化的研究目前很少見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)雙孢菇培養(yǎng)料二次發(fā)酵過(guò)程中的細(xì)菌、霉菌、放線菌的數(shù)量變化，包括物理感官特性、含水量、pH值、硝態(tài)氮含量這些理化指標(biāo)，為更全面了解在此過(guò)程中微生物對(duì)于培養(yǎng)基中底物的降解及產(chǎn)物生成的促進(jìn)作用并通過(guò)微生物調(diào)控提高發(fā)酵效率提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

雙孢菇培養(yǎng)料，取自山東省九發(fā)食用菌股份有限公司的培養(yǎng)料制備車間。培養(yǎng)料配方見(jiàn)表1。

表1 雙孢菇培養(yǎng)料成分Table1 Components of the Agaricus bisporus compost used in this study

1.2 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基用于細(xì)菌的培養(yǎng)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基用于霉菌的培養(yǎng)；高氏一號(hào)培養(yǎng)基用于放線菌的培養(yǎng)。

1.3 樣品編號(hào)及取樣時(shí)間

表2 雙孢菇培養(yǎng)料樣品編號(hào)及取樣時(shí)間Table2 Collection time points of Agaricus bisporus compost and corresponding numbers

1.4 雙孢菇培養(yǎng)料的采集

在每次倒料過(guò)程中分別每5～7鏟車取樣100g，使得能夠取到培養(yǎng)料堆各部位的樣品。取樣后放入液氮中速凍后于－80℃保存。

1.5 方法

1.5.1 細(xì)菌總數(shù)測(cè)定

參照GB/T 13093—1991《飼料中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定方法》進(jìn)行測(cè)定。無(wú)菌稱取10.0g樣品，放入含有90mL無(wú)菌水的三角瓶?jī)?nèi)(瓶?jī)?nèi)預(yù)先加有適量的玻璃珠)，200r/min振蕩30min，制成1:10的混勻稀釋液。吸取10-1稀釋液1mL，沿管壁慢慢注入含有9mL稀釋液的試管內(nèi)，混合均勻做成1:100的稀釋液。另取一支1mL滅菌吸管，按上述操作順序，做10倍遞增稀釋，如此依次稀釋。選擇3個(gè)適宜稀釋度，吸取該稀釋度的1mL稀釋液于固體培養(yǎng)基的平皿內(nèi)，用涂布棒涂布均勻。細(xì)菌選擇10-5、10-6、10-7這3個(gè)稀釋度涂布，用NA培養(yǎng)基于適宜溫度下培養(yǎng)(表3)。計(jì)數(shù)，同時(shí)做3個(gè)平行。

表3 雙孢菇培養(yǎng)料的微生物培養(yǎng)溫度Table3 Culture temperatures of microbes from samples of Agaricus bisporus compost collected during fermentation

1.5.2 霉菌及放線菌總數(shù)測(cè)定

參照GB/T 13092—1991《飼料中霉菌的檢驗(yàn)方法》進(jìn)行測(cè)定。霉菌選擇10-1、10-2、10-3這3個(gè)稀釋度涂布于PDA培養(yǎng)基平皿，放線菌選擇10-3、10-4、10-5這3個(gè)稀釋度涂布于高氏一號(hào)培養(yǎng)基平皿，霉菌和放線菌的培養(yǎng)溫度見(jiàn)表3。

1.5.3 培養(yǎng)基的物理感官特征評(píng)定

每次取樣時(shí)，記錄培養(yǎng)基的氣味、顏色及韌度。其中氣味分為酸味、氨味、霉味及發(fā)酵香味4種，強(qiáng)度分為強(qiáng)、中、弱；顏色有棕黃、棕黑、青、白4種；韌性以秸稈能夠承受的最大拉力大小判斷，分為強(qiáng)、中、弱；蠟質(zhì)去除率以秸稈表面能夠直接被手捻掉的蠟質(zhì)面積占總表面積的比值計(jì)算。

1.5.4 含水量測(cè)定

參照GB/T 6435—2006《飼料中水分和其他揮發(fā)性物質(zhì)含量的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。按四分法取樣品5.00g，置于95～105℃干燥箱中，瓶蓋斜放于瓶邊，加熱(4±0.1)h，取出蓋好，放在干燥器中冷卻0.5h，稱其質(zhì)量。

式中：m1為稱樣皿和樣品的質(zhì)量；m2為稱樣皿和樣品干燥后的質(zhì)量；m為樣品的質(zhì)量。

1.5.5 pH值測(cè)定

參照王旭明等[10]的方法測(cè)定。準(zhǔn)確稱取樣品10.00g，加入100mL重蒸水中，充分混勻后靜置15min，過(guò)濾后測(cè)濾液的pH值。

1.5.6 硝態(tài)氮含量測(cè)定

參照GB/T 5009.33—2003《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。采用鹽酸萘乙二胺法測(cè)定樣品中亞硝酸鹽的質(zhì)量，采用隔柱法測(cè)定樣品中硝酸鹽的質(zhì)量，亞硝酸鹽與硝酸鹽的質(zhì)量和即為培養(yǎng)料中硝態(tài)氮的質(zhì)量，計(jì)算培養(yǎng)料干質(zhì)量中的硝態(tài)氮質(zhì)量。

1.5.7 數(shù)據(jù)分析

每組測(cè)定做3個(gè)平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS 13.0)對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(ANOVA)與多重比較分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，并用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙孢菇培養(yǎng)基中微生物的變化

雙孢菇培養(yǎng)基在工廠化制備過(guò)程中，即二次發(fā)酵期間細(xì)菌、霉菌及放線菌的數(shù)量變化如圖1所示。

圖1 發(fā)酵期間培養(yǎng)基中微生物數(shù)量的變化Fig.1 Changes in microbial numbers during fermentation of Agaricus bisporus compost

由圖1可見(jiàn)，細(xì)菌的數(shù)量最多，達(dá)到108數(shù)量級(jí)之上；其次是放線菌，達(dá)到105～106數(shù)量級(jí)；霉菌的數(shù)量最少，為102～103數(shù)量級(jí)。當(dāng)原料浴濕混勻后(f0)，微生物的數(shù)量最多，細(xì)菌總數(shù)為1.45×109CFU/g，放線菌總數(shù)為2.09×107CFU/g，霉菌總數(shù)為1.20×104CFU/g。進(jìn)入前發(fā)酵階段后培養(yǎng)料的溫度上升至70～80℃，微生物數(shù)量下降，嗜熱微生物開(kāi)始繁殖，其中細(xì)菌總數(shù)的下降程度最小，在第3次倒料時(shí)(f3)為1.50×108CFU/g；放線菌總數(shù)在第2次倒料時(shí)(f2)下降最多，為8.50×104CFU/g，隨后在第3次倒料時(shí)又增加到3.60×106CFU/g；霉菌總數(shù)在第2次倒料時(shí)下降為50CFU/g，在第3次倒料時(shí)又增加到100CFU/g。二次發(fā)酵期間(f1～f5)的微生物都是在50℃的高溫下培養(yǎng)的，為嗜熱微生物。第4次倒料(f4)時(shí)嗜熱細(xì)菌、放線菌及霉菌的數(shù)量都有所上升，分別為2.10×109、4.00×106CFU/g和1.50×103CFU/g。而經(jīng)過(guò)后發(fā)酵的巴氏殺菌過(guò)程，嗜熱的細(xì)菌和霉菌數(shù)量有所下降，分別變?yōu)?.20×108CFU/g和3.70×106CFU/g；而嗜熱霉菌的數(shù)量有所上升，為2.40×103CFU/g。

2.2 培養(yǎng)基的物理感官特征變化

雙孢菇的培養(yǎng)料在二次發(fā)酵期間物理感官特征的變化如表4所示。結(jié)果表明，在前發(fā)酵期間的高溫環(huán)境下，隨著微生物對(duì)于培養(yǎng)基中物質(zhì)的分解及培養(yǎng)基自身物質(zhì)的高溫化學(xué)反應(yīng)，使得酸味逐漸減小，氨味先增加后減少，當(dāng)前發(fā)酵結(jié)束時(shí)(f4)培養(yǎng)基中無(wú)酸味和氨味并產(chǎn)生了發(fā)酵的香味，后發(fā)酵結(jié)束時(shí)(f5)一些嗜熱霉菌的生長(zhǎng)使得培養(yǎng)基的霉味增加。培養(yǎng)基的顏色由黃色逐漸地變?yōu)樽睾谏⑶译S著放線菌的生長(zhǎng)使得培養(yǎng)基中白色的面積增加，后發(fā)酵結(jié)束后培養(yǎng)基中白色占總面積的60%。隨著發(fā)酵的進(jìn)行培養(yǎng)基中秸稈的纖維被分解，能夠承受的拉力逐漸減小，并且蠟質(zhì)易去除率增加，到后發(fā)酵結(jié)束時(shí)達(dá)到60%，此時(shí)的麥秸纖維手捻可散。

表4 發(fā)酵期間培養(yǎng)基的物理感官特征變化Table4 Changes in physical and sensory characteristics during fermentation of Agaricus bisporus compost

2.3 培養(yǎng)基的化學(xué)成分變化

雙孢菇培養(yǎng)料在二次發(fā)酵期間的含水量、pH值及硝態(tài)氮含量的變化如表5所示。

表5 發(fā)酵期間培養(yǎng)基化學(xué)成分變化Table5 Changes in chemical characteristics during fermentation of Agaricus bisporus compost

由表5可見(jiàn)，在二次發(fā)酵過(guò)程中，含水量呈減少趨勢(shì)，由開(kāi)始的76.8%顯著減少至64.8%(P≤0.05)。在前發(fā)酵期間，培養(yǎng)料為堿性，pH值先呈下降趨勢(shì)，由7.11降為7.03，但差異不顯著(P＞0.05)，第3次倒料時(shí)上升為7.68，與f0差異顯著(P≤0.05)，前發(fā)酵結(jié)束時(shí)(f4)又降為7.40，后發(fā)酵結(jié)束時(shí)又增為7.76。硝態(tài)氮含量先由原料浴濕后的35.62mg/kg顯著降低至第3次倒料時(shí)的4.23mg/kg(P≤0.05)，然后在第4次倒料時(shí)增加為18.77mg/kg，與f0差異顯著(P≤0.05)，后發(fā)酵結(jié)束時(shí)為14.41mg/kg。

3 討 論

工廠化制備雙孢菇培養(yǎng)基是一個(gè)非人工加熱而自產(chǎn)熱滅菌的二次發(fā)酵過(guò)程，通過(guò)嗜熱微生物的生長(zhǎng)代謝和群落交替作用結(jié)合人工對(duì)于溫度的控制將培養(yǎng)基中的成分轉(zhuǎn)化為利于蘑菇吸收、利用的基質(zhì)[4]。前發(fā)酵過(guò)程中一些中溫性的微生物生長(zhǎng)，利用原料中較為簡(jiǎn)單的有機(jī)質(zhì)，產(chǎn)生熱量，料溫迅速上升，使得細(xì)菌、放線菌和霉菌的數(shù)量都有所降低，同時(shí)產(chǎn)生了有機(jī)酸使得培養(yǎng)料的pH值隨之下降并且有酸味。隨著料溫的繼續(xù)升高，嗜熱微生物開(kāi)始大量繁殖，因此細(xì)菌、放線菌和霉菌的數(shù)量在第2次倒料后，開(kāi)始呈上升趨勢(shì)，同時(shí)培養(yǎng)基中氨氣使得培養(yǎng)基的pH值開(kāi)始升高并且培養(yǎng)料開(kāi)始有刺鼻的氨味。另外由于微生物的降解作用，使培養(yǎng)基中的硝態(tài)氮含量減少。同時(shí)，在高溫環(huán)境下，培養(yǎng)料中的碳水化合物發(fā)生焦糖化反應(yīng)使得培養(yǎng)基的顏色由黃色變?yōu)樽睾谏?，并且隨著嗜熱放線菌的大量繁殖，培養(yǎng)基中呈白色的面積增加。

經(jīng)過(guò)后發(fā)酵的巴氏殺菌過(guò)程，細(xì)菌和放線菌的數(shù)量減少，霉菌的耐熱性較強(qiáng)，霉菌數(shù)量增加，因此培養(yǎng)基有霉味。由于高溫下水分的揮發(fā)，培養(yǎng)基的水分含量一直呈下降趨勢(shì)。細(xì)菌和真菌能夠降解木質(zhì)素[11]，因此經(jīng)過(guò)二次發(fā)酵后培養(yǎng)料中的秸稈用手捻即可散開(kāi)。由于培養(yǎng)基中的氨化物被嗜熱放線菌固定，最終以富含氮的木質(zhì)素-腐殖質(zhì)復(fù)合體的形式存在[12]，因此后發(fā)酵結(jié)束時(shí)硝態(tài)氮的含量較前發(fā)酵期間顯著增加。

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