張 巒，黃立群，喻曉蔚，徐 巖，黃衛(wèi)寧,*，TILLEY Michael

(1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；3.美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究局谷物市場與生產(chǎn)研究中心，美國 堪薩斯州 66502)

隨著烘焙工業(yè)的快速發(fā)展，消費(fèi)者對(duì)烘焙產(chǎn)品品質(zhì)的要求日益提升，一些對(duì)人體存在危害的化學(xué)改良劑如溴酸鉀等，逐漸被市場淘汰。如何使用天然無害、具有替代功能的食品添加劑已經(jīng)成為烘焙行業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn)[1]。生物酶不僅可以大大改善面包的烘焙品質(zhì)，同時(shí)還具備催化效率高、用量少、操作條件溫和等優(yōu)點(diǎn)[2]。此外高溫烘焙過程可使絕大多數(shù)酶變性失活，因而不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒副作用。

脂肪酶是可用于提高烘焙產(chǎn)品品質(zhì)的酶之一[3]。脂肪酶[4](EC3.1.1.3，lipase)是一類特殊的酯鍵水解酶，作為生物體內(nèi)一類重要的代謝酶，其主要作用機(jī)理是將甘油三酯水解生成甘油一酯、甘油二酯和甘油[5]，甘油一酯、甘油二酯均為優(yōu)良的乳化劑。近年來，脂肪酶在烘焙制品中的應(yīng)用引起了國內(nèi)外學(xué)者的研究興趣[6-8]，然而，傳統(tǒng)方法制備的脂肪酶，因其制備成本較高，未能實(shí)現(xiàn)在烘焙制品工業(yè)化生產(chǎn)中的大規(guī)模應(yīng)用。

根霉脂肪酶是一類典型的微生物脂肪酶，獨(dú)特的催化特性使其在脂肪酶理論研究和實(shí)際應(yīng)用中都占有重要地位。傳統(tǒng)脂肪酶的生產(chǎn)是應(yīng)用誘變野生菌的方法篩選出的，而本實(shí)驗(yàn)采用的脂肪酶是采用基因重組技術(shù)高效、精確的改造微生物酶基因，使酶獲得新的特性[9-10]。江南大學(xué)生物工程學(xué)院以華根霉(Rhizopus chinensisCCTCCM201021)為出發(fā)菌株，提取總DNA，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增出前導(dǎo)肽脂肪酶基因(proRCL)，利用基因重組技術(shù)構(gòu)建脂肪酶基因的分泌表達(dá)載體，克隆到真核表達(dá)載體ppzc9k，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，利用真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生一種新型重組華根霉脂肪酶(Rhizopus chinensislipase，RCL)[11]。

本實(shí)驗(yàn)所用的新型重組脂肪酶可以通過基因重組技術(shù)和生物發(fā)酵技術(shù)從微生物中大量提取，最大化的降低生產(chǎn)成本，性價(jià)比較高。這也為脂肪酶在烘焙制品工業(yè)化生產(chǎn)中的大規(guī)模應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。雖然國內(nèi)外對(duì)脂肪酶已經(jīng)有了一些研究，并且取得了一些進(jìn)展，但機(jī)理至今還未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)借助新型研究手段——酶流變分析儀分析研究脂肪酶對(duì)面團(tuán)熱機(jī)械學(xué)特性的影響，同時(shí)為今后進(jìn)一步深入探索脂肪酶在面團(tuán)制品中的作用機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥粉(福臨門加楓牌特級(jí)高筋粉) 中糧(張家港)東海糧油有限公司；活性干酵母(燕山即發(fā)干酵母) 河北馬利食品有限公司；精制食鹽、白砂糖(均為食品級(jí)) 市售；起酥油(全統(tǒng)酥油) 臺(tái)灣強(qiáng)冠企業(yè)股份有限公司。

重組脂肪酶(RCL，酶活17640U/g) 江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；脂肪酶AY“AMANO”(AY，酶活30000U/g) 阿瑪諾天野酶制劑商貿(mào)(上海)有限公司；p-NPP、EDTA、2-丁酮、丙酮、乙醚、甲醇 國藥(上海)集團(tuán)；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

酶流變分析儀 法國Chopin公司；GZX-9540 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；攪拌機(jī)、醒發(fā)箱、烤箱 上海早苗食品有限公司：質(zhì)構(gòu)儀 英國Stablele Microsystems公司。

1.3 方法

1.3.1 酶活力測定

根霉脂肪酶活測定方法為p-NPP法[12]。將溶解有底物30mg對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯的10mL異丙醇和溶解有207mg脫氧膽酸鈉和100mg阿拉伯樹膠粉的90mL 0.05mol/L的磷酸鉀緩沖液混勻備用。在反應(yīng)體系中加入2.4mL上述底物，加入0.1mL適當(dāng)稀釋的酶液，一定條件下反應(yīng)，在410nm波長處用空白作為對(duì)照測定吸光度A410nm，根據(jù)對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，由吸光度查出對(duì)硝基苯酚的濃度并計(jì)算酶活力。一個(gè)酶活力的定義為一定反應(yīng)條件下每分鐘產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯酚的酶量為一個(gè)脂肪酶水解酶活力國際單位。

1.3.2 酶學(xué)性質(zhì)研究

1.3.2.1 pH值對(duì)脂肪酶活力和穩(wěn)定性的影響

pH值對(duì)脂肪酶活力的影響[10]：將脂肪酶液分別用不同pH值(pH6.0～10.0)的緩沖液稀釋，按標(biāo)準(zhǔn)方法測脂肪酶活力，以最高酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

pH值對(duì)脂肪酶活力穩(wěn)定性的影響[10]：將脂肪酶液用不同pH值(pH6.0～10.0)的緩沖液稀釋，25℃保溫1h，按標(biāo)準(zhǔn)方法測殘余酶活力，以未保溫酶液的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.3.2.2 溫度對(duì)脂肪酶活力和穩(wěn)定性的影響

溫度對(duì)脂肪酶活力的影響[10-11]：將脂肪酶液分別在不同的溫度(20～60℃)下按標(biāo)準(zhǔn)方法測定脂肪酶活力。

溫度對(duì)脂肪酶活力穩(wěn)定性的影響[10-11]：將脂肪酶液分別在不同的溫度(20～60℃)下保溫1h，迅速冷卻，按標(biāo)準(zhǔn)方法測殘余脂肪酶活力，以未保溫酶液的活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.3.3 脂肪酶對(duì)面團(tuán)熱機(jī)械學(xué)特性測定

水分測定參照 AACC44-15A[13]。采用酶流變分析儀[14]測定小麥粉加水混合形成面團(tuán)過程、面團(tuán)加熱糊化過程和冷卻過程面團(tuán)熱機(jī)械學(xué)特性變化，同時(shí)該設(shè)備還可用來分析加熱冷卻過程中面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及淀粉的性質(zhì)。分別對(duì)含0、1000、2000U/kg (以小麥粉質(zhì)量計(jì))脂肪酶的小麥粉進(jìn)行測定，攪拌速度80r/min；首先保溫7min，以2.3℃/min的速率升溫至90℃，保持7min，后以4℃/min的速率降溫至50℃，保持5min，總時(shí)間為45min。

由酶流變分析儀圖譜可得到以下參數(shù)[15-18]：吸水率指使面團(tuán)產(chǎn)生(1.1±0.07)N·m所需的加水量/%；面團(tuán)形成時(shí)間指在30℃達(dá)到最大扭矩所需時(shí)間/min；穩(wěn)定時(shí)間指面團(tuán)所產(chǎn)生的扭矩保持在1.1N·m的時(shí)間/min；C1用來表征面粉的實(shí)際吸水率；最小扭矩(C2)為在面團(tuán)形成過程中受到機(jī)械或熱力作用時(shí)的最小扭矩值；峰值扭矩(C3)為面團(tuán)在加熱階段產(chǎn)生的最大扭矩；C4為加熱時(shí)的最小扭矩；C5為冷卻至50℃的扭矩；蛋白質(zhì)弱化(C1－C2)為在30℃時(shí)的最大扭矩與最小扭矩的差值；C4/C3為蒸煮穩(wěn)定性；回值(C5－C4)為冷卻到50℃的扭矩與加熱時(shí)最小扭矩之差。此外，曲線中扭矩的升降斜率表示為α、β、γ，分別對(duì)應(yīng)3個(gè)角的ta n值，α表示的是蛋白質(zhì)隨溫度穩(wěn)步上升發(fā)生的弱化；β表示淀粉的糊化；γ表示淀粉的破損。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)操作兩次。

1.3.4 面包樣品的制備[19]

原料添加量為小麥粉100%、食鹽1%、白砂糖8%、黃油8%、酵母1.5%、水60% (均以小麥粉質(zhì)量計(jì))，脂肪酶的添加量分別為0、1000、2000U/kg。將上述原料于攪拌機(jī)中攪拌10min后，靜置10min，分割成100g/塊，搓圓，靜置20min，裝盤，于38℃、相對(duì)濕度85%的條件下醒發(fā)90min，烘焙15min(上火170℃、下火210℃)，冷卻后測量比容、質(zhì)構(gòu)等。

1.3.5 面包比容測定

菜籽置換法[19]測定面包體積并稱質(zhì)量。

1.3.6 面包感官評(píng)價(jià)

參照GB/T 14611—1993《小麥粉面包烘焙品質(zhì)試驗(yàn)法》評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)面包鑒定評(píng)分。

1.3.7 面包全質(zhì)構(gòu)測定[20]

將面包芯切成厚度為20mm的厚薄均勻的薄片，選取中間固定位置進(jìn)行測定后取平均值。參數(shù)設(shè)定[14]：探頭型號(hào)為P/36型探頭、測試前速率1.0mm/s、測試速率3.0mm/s、測試后速率3.0mm/s、壓縮程度50%、感應(yīng)力5g、兩次壓縮間隔時(shí)間1s。

1.4 數(shù)據(jù)收集和統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)中測定所得的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用S P S S軟件及Microsoft office Excel 2007進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.1.1 最適pH值和pH值穩(wěn)定性

圖1 pH值對(duì)脂肪酶活力的影響Fig.1 Optimum reaction pH for two lipases

酶催化反應(yīng)速率與pH值有關(guān)，在不同pH值條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，測定酶液的脂肪酶活力，結(jié)果見圖1、2。

由圖1可知，重組脂肪酶催化反應(yīng)的最適pH值分別為8.5，pH值的增加或降低都會(huì)導(dǎo)致脂肪酶活力的顯著下降，說明重組脂肪酶為一種堿性脂肪酶。而脂肪酶AY最適pH值為7，為中性脂肪酶。

圖2 pH值對(duì)脂肪酶活力穩(wěn)定性的影響Fig.2 pH stability of two lipases

經(jīng)過不同pH值放置1h后測定酶液的脂肪酶活力，與最適pH值的酶活力作為對(duì)照計(jì)算殘余酶活力。從圖2可以看出重組脂肪酶在pH3～9范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，而脂肪酶AY的pH值穩(wěn)定性相對(duì)較差。

2.1.2 最適溫度和熱穩(wěn)定性

圖3 溫度對(duì)脂肪酶活力的影響Fig.3 Optimum reaction temperature for two lipases

圖4 溫度對(duì)脂肪酶活力穩(wěn)定性的影響Fig.4 Thermal stability of two lipases

酶催化反應(yīng)速率與溫度有關(guān)，在不同溫度條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，測定酶液的脂肪酶活力，結(jié)果見圖3、4。

由圖3可以得出，重組脂肪酶催化反應(yīng)的最適溫度為40℃。隨著溫度的升高，酶活力也逐漸升高；但是當(dāng)溫度高于40℃后，酶蛋白逐漸變性，酶蛋白活力顯著下降；AY脂肪酶的溫度范圍相對(duì)更寬，最適溫度為45～50℃。

經(jīng)過不同溫度下保溫1h后測定酶液的脂肪酶活力，與不保溫的酶活力作為對(duì)照計(jì)算殘余酶活力。從圖4可以看出，重組脂肪酶在高于最適溫度后活力下降顯著，在40℃以下較為穩(wěn)定；AY脂肪酶的熱穩(wěn)定性相對(duì)更好。

2.2 脂肪酶對(duì)面團(tuán)熱機(jī)械學(xué)特性的影響

表1 不同脂肪酶添加量對(duì)面團(tuán)熱機(jī)械學(xué)特性的影響Table1 Effect of separate amounts of two lipases on thermomechanical characteristics of dough

從表1可以看出： 1)C1：向面粉中添加不同量的脂肪酶后，C1值略有增加，說明添加脂肪酶后可使得面粉的吸水率增加。2)面團(tuán)形成時(shí)間：面團(tuán)形成時(shí)間主要與蛋白質(zhì)的含量呈正相關(guān)，添加脂肪酶后，面團(tuán)形成時(shí)間增加，說明脂肪酶具有提高面團(tuán)筋力的作用，尤其是脂肪酶AY，對(duì)面團(tuán)筋力的改善效果更明顯；3)面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間：面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間主要用來表征面團(tuán)的耐揉性，穩(wěn)定時(shí)間越長，面團(tuán)的韌性越好，面筋的強(qiáng)度越大，面團(tuán)的加工特性越佳。由表1可知，脂肪酶AY對(duì)面團(tuán)耐揉性影響不顯著，但是脂肪酶RCL會(huì)在一定程度上降低面團(tuán)的耐揉性；4)C1寬度：主要用來表征面團(tuán)的彈性，寬度越大，面團(tuán)的彈性越大。添加脂肪酶后，面團(tuán)的彈性大大增加，而且脂肪酶RCL對(duì)面團(tuán)的增加效果更明顯；5)回值(C5－C4)：回值描述的是淀粉的凝膠化過程，由于加熱處理，使直鏈淀粉從淀粉顆粒中釋放出來，從而促進(jìn)了直鏈淀粉重結(jié)晶。淀粉分子間特別是直鏈淀粉相互結(jié)合，形成了凝膠結(jié)構(gòu)。該過程與淀粉分子的老化和重排相關(guān)。隨著脂肪酶含量的增加，回值增加比較明顯，尤其是脂肪酶AY；6)脂肪酶對(duì)面團(tuán)的蛋白質(zhì)弱化度和蒸煮穩(wěn)定性基本上沒有什么影響。

2.3 脂肪酶對(duì)面包烘焙品質(zhì)的影響

2.3.1 脂肪酶對(duì)面包比容的影響

圖5 脂肪酶添加量對(duì)面包比容的影響Fig.5 Effect of two lipases on specific volume of bread

由圖5可知，添加脂肪酶后，面包的比容有較大增長。其中脂肪酶的添加量為1000U/kg時(shí)，面包比容增加效果明顯，但是隨著添加量的增加，面包的比容有較大的下降。對(duì)不同的脂肪酶來說，在相同酶活力的情況下，RCL比 AY效果更好。當(dāng)脂肪酶添加量為1000U/kg時(shí)，RCL使比容增加約31.16%，AY使比容增加約21.86%。

2.3.2 脂肪酶對(duì)面包感官品質(zhì)的影響

圖6 脂肪酶添加量對(duì)面包感官指標(biāo)的影響Fig.6 Effect of two lipases on sensory evaluation of bread

由圖6可知，添加脂肪酶后，面包的感官品質(zhì)有較大程度的提升，但是隨著添加量的增加，面包的感官品質(zhì)略有降低。當(dāng)酶的添加量達(dá)到2000U/kg時(shí)，口感、黏彈性和比容都有一定程度的下降。但是通過2種脂肪酶的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，添加RCL比AY更有助于提高面包的感官品質(zhì)。

2.3.3 脂肪酶對(duì)面包內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響

圖7 脂肪酶對(duì)面包內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響Fig.7 Visible observation of the effect of two lipases on texture of bread

由圖7可知，不添加脂肪酶的面包，面包氣孔大小不均勻，孔壁較厚；添加脂肪酶后，面包的氣孔更加緊密，氣孔大，較均勻，成海綿狀，按壓后恢復(fù)速度快，彈性好。此外，添加1000U/kg脂肪酶的面包，相對(duì)于2000U/kg來說，氣孔緊密型更好，同時(shí)添加RCL比添加AY效果更顯著。

2.3.4 面包的全質(zhì)構(gòu)分析

對(duì)面包質(zhì)構(gòu)的分析不僅可以通過感官評(píng)定，還可以通過質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行評(píng)價(jià)。而且相對(duì)來說采用質(zhì)構(gòu)儀測定的更為準(zhǔn)確和方便。

表2 脂肪酶對(duì)面包質(zhì)構(gòu)特性的影響Table2 Effect of two lipases on the values of texture parameters of bread

由表2可知，兩種脂肪酶的添加都使面包的硬度降低，但隨著脂肪酶添加量的增加，面包的硬度回升。當(dāng)脂肪酶添加量為1000U/kg時(shí)，含RCL的面包比含AY的面包硬度減少更顯著，面包更松軟；兩種脂肪酶的添加均使面包的彈性增加，且RCL對(duì)面包彈性的影響與AY幾近相同；兩種酶對(duì)面包黏聚性的影響差別較大，含RCL的面包黏聚性下降，而含AY的面包略有上升；含RCL面包咀嚼性略有降低，而含AY的面包咀嚼性基本不變。兩種酶均可改善面包的質(zhì)構(gòu)，RCL的改善效果優(yōu)于AY。

2.4 面包感官品質(zhì)和面包各質(zhì)構(gòu)參數(shù)之間的相關(guān)性分析

表3 面包感官品質(zhì)和各質(zhì)構(gòu)參數(shù)之間的相關(guān)性Table3 Correlation coefficients between texture parameters and sensory score of bread

由表3可知，面包的感官品質(zhì)和面包的比容成顯著正相關(guān)，其主要原因應(yīng)歸結(jié)于面包感官評(píng)分中比容評(píng)分占到35%的緣故；面包的品質(zhì)與面包的彈性呈正相關(guān)，與硬度呈負(fù)相關(guān)，面包硬度越小，則彈性越大，品質(zhì)越好；同時(shí)其感官品質(zhì)與黏聚性和咀嚼性均為負(fù)相關(guān)。

3 結(jié) 論

本研究針對(duì)脂肪酶改善面包烘焙品質(zhì)方面進(jìn)行了初步研究。結(jié)果顯示：RCL的最適反應(yīng)條件為40℃、pH8.5，其在40℃以下、pH3～9范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，RCL凍干粉酶比活力約為17640U/g；兩種脂肪酶均顯著影響面團(tuán)的熱機(jī)械學(xué)特性，提高面團(tuán)的筋力和彈性。兩種脂肪酶對(duì)面包的烘焙品質(zhì)也有明顯的改善作用，特別是重組脂肪酶RCL，不僅能夠增加面包的比容和彈性，同時(shí)還能降低面包的硬度、黏聚性和咀嚼性。

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