范建鳳，王澤南*，楊 柯，李洪波，郭俊珍，周小芬

(合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009)

天然抗氧化肽具有較強的抗氧化活性和很高的安全性，近年來已成為各國研究的重點。從水產(chǎn)品中以酶解法制備抗氧化肽已經(jīng)得到廣泛研究[1]，如Binsan等[2]從白蝦頭中提取出抗氧化肽具有很好的體外清除自由基及還原能力，Qian等[3]分別用多種酶水解牛蛙皮蛋白提取并純化得到抗氧化活性很高的多肽，這充分證明水產(chǎn)品中的優(yōu)質(zhì)蛋白具有制備抗氧化肽的潛力。蟹下腳料中除了含甲殼質(zhì)外，還含有豐富的蛋白質(zhì)，目前國內(nèi)對蟹下腳料的研究主要集中在甲殼素的制備等方面，而對其蛋白水解產(chǎn)物抗氧肽制備與分離純化方面尚未見報道。

本實驗選用中性蛋白酶水解蟹下腳料制得蟹抗氧化肽，再采用葡聚糖凝膠進行分離純化，并對分離所得樣品的理化特性進行測定，旨在為蟹下腳料的抗氧化肽開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

梭子蟹下腳料 汕頭市僑豐集團有限公司。

葡聚糖凝膠G-25 上海貝基生物科技有限公司；鐵氰化鉀、鄰二氮菲、鄰苯三酚、三氯乙酸、重水、硫酸亞鐵(均為分析純)；乙腈(色譜純)。

BT200恒流泵、自動收集器、核酸蛋白檢測器 上海奇特儀器有限公司；層析柱(1.6cm×50cm) 上海貝基生物科技有限公司；721分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；TDL-50B離心機 上海安亭科學儀器廠；FD-1型真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；S433D氨基酸自動分析儀 德國SYKAM公司。

1.2 方法

1.2.1 蟹抗氧化肽粗品的制備工藝流程[4]

蟹下腳料→脫脂→水浴熱處理→酶解→滅酶→離心(4000r/min，10min)過濾→抗氧化肽粗品

1.2.2 蟹抗氧化肽粗品的分離純化[5]

通過葡聚糖凝膠G-50與G-25對蟹抗氧化肽粗品進行兩步分離純化。將粗品配制成質(zhì)量濃度為5g/100mL的溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后用葡聚糖G-50進行分離，上樣量為1mL，以蒸餾水為洗脫液，流速為1mL/min，檢測波長為280nm，分管收集，每管2mL，合并同一分離峰的洗脫液，冷凍干燥，測定各分離組分的還原力。將還原力最大的組分繼續(xù)經(jīng)葡聚糖G-25進行分離，步驟同上。

1.2.3 蟹抗氧化肽的相對分子質(zhì)量測定[6-7]

分離后所得的組分由Sephadex G-25分析檢測其相對分子質(zhì)量。以蒸餾水為洗脫液，樣品流速為1mL/min，標準樣分別為牛血清蛋白、還原型輔酶Ⅰ、VB12，其相對分子質(zhì)量(Mr)分別為67000、663.45、1302。測定各標準樣的洗脫體積(Ve)，以標準樣的相對分子質(zhì)量的對數(shù)值lgMr為橫坐標，Ve為縱坐標制作標準曲線。樣品液的相對分子質(zhì)量由其洗脫體積和標準曲線求得。

1.2.4 蟹抗氧化肽抗氧化特性的測定

實驗通過測定三價鐵離子還原力、清除超氧自由基能力和清除羥自由基能力來綜合反映蟹抗氧化肽的抗氧化性。

1.2.4.1 還原力的測定

采用Viliak等[8]的方法并稍作修改。取樣品液0.1mL，加入0.2mol/L PBS溶液(pH6.6)和1g/100mL的鐵氰化鉀溶液各2.5mL，混合物于50℃水浴中加熱20min，再加10g/100mL三氯乙酸溶液2.5mL，充分混合后，3000r/min離心5min。取上清液2.5mL，加入蒸餾水2.5mL和0.1g/100mL三氯化鐵溶液0.5mL，靜置10min后，在700nm波長處測定其吸光度A700nm。以A700nm值反映還原力大小，A700nm值越高，水解物的還原力越大。

1.2.4.2 超氧自由基清除率的測定

采用Wu等[9]的方法，并稍作修改。將0.1mL樣品液加入2.8mL pH8.2的Tris-HCl緩沖溶液中，空白組加入去離子水，25℃ 10min后加入0.1mL 3mmol/L的鄰苯三酚溶液(25℃水浴預熱)，迅速混勻并計時，320nm波長處測定吸光度，隔30s讀取一次，5min結(jié)束。以0.2mL去離水加2.8mL 0.1mol/mL pH8.2的磷酸緩沖液調(diào)零。作吸光度隨時間變化的回歸方程，其斜率為樣品鄰苯三酚自氧化速率(V樣品)；空白對照管以蒸餾水代替樣品，測定鄰苯三酚自氧化速率(V對照)。

1.2.4.3 羥自由基清除率的測定

采用Thiansilakul等[10]的方法，并稍作修改。取5mmol/L鄰二氮菲溶液0.6mL加入PBS(pH7.4)0.6mL，充分混合，加入2mL多肽溶液以及體積分數(shù)0.1%的雙氧水0.4mL搖勻，37℃ 1h后，測定樣品液在波長536nm處的吸光度(A樣品)。按照上述操作，采用去離子水代替樣品液測得損傷管吸光度(A損傷)，采用去離子水代替樣品液和雙氧水測得未損傷管吸光度(A未損傷)。

1.2.5 蟹抗氧化肽的純度鑒定[11-12]

將分離后活性最高的組分用HPLC法測定其純度。取樣品用重蒸水溶解、過濾。層析條件：Restek C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈與重蒸水(含體積分數(shù)0.1%三氟乙酸)體積比1:19；流速為1mL/min；進樣量為5μL；檢測波長為280nm。

1.2.6 蟹抗氧化肽的氨基酸組成分析[13]

采用GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》中的方法，將純化后的蟹抗氧化肽組分用6mol/L HCl溶液于110℃水解24h，然后將水解液蒸干，用氨基酸自動分析儀對氨基酸組成進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟹抗氧化肽粗品的分離

2.1.1 蟹抗氧化肽粗品第一步分離純化結(jié)果

圖1 葡聚糖凝膠G-50分離抗氧化肽粗品的洗脫曲線Fig.1 Elution profile of crude antioxidant peptides from swimming crab wastes on Sephadex G-50 column

從圖1可以看出，蟹抗氧化肽粗品經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后用葡聚糖凝膠G-50進行分離，得到組分a與組分b，含量分別為80.24%、16.33%，將其配成質(zhì)量濃度為0.03g/mL的溶液，測定其還原力，發(fā)現(xiàn)組分a的A700nm為0.720，遠大于組分b的A700nm為0.324，對組分a繼續(xù)進行分離純化。

2.1.2 蟹抗氧化肽粗品第二步分離純化結(jié)果

圖2 Sephadex G-25分離組分a的洗脫曲線Fig.2 Elution profile of fraction No.a on Sephadex G-25 column

從圖2可以看出，組分a經(jīng)Sephadex G-25洗脫后得到3個洗脫峰，分別標記為組分1、組分2、組分3，含量分別為 17.78%、41.44%、26.23%。

2.2 蟹抗氧化肽的相對分子質(zhì)量分布

對分離純化后得到的3個組分測定其相對分子質(zhì)量分布，標準曲線如圖3所示。

圖3 葡聚糖凝膠G-25層析測定相對分子質(zhì)量的標準曲線Fig.3 Standard curve of molecular weight determined by Sephadex G-25 chromatography

由圖3可得，標準洗脫曲線回歸方程Ve=－10.37lgMr＋71.77，推測所分離抗氧化肽的相對分子質(zhì)量Mr=10Ve－71.77÷(－10.37)。根據(jù)組分1的出峰體積為16.8mL、組分2的出峰體積為28.4mL、組分3的出峰體積為40.2mL，可得組分1的相對分子質(zhì)量約19.95×104，組分2的相對分子質(zhì)量約1.5×104，組分3的相對分子質(zhì)量約1096.5。

2.3 蟹抗氧化肽的抗氧化特性

表1 蟹抗氧化肽的抗氧化特性Table1 Scavenging rates of crude antioxidant peptides from swimming crab wastes and various subfractions of their raction No.a against hydroxyl and superoxide anion free radicals

將分離所得的3個組分與蟹抗氧化肽粗品配制成質(zhì)量濃度為0.02g/mL的溶液，分別測定其還原力、羥自由基清除能力、超氧自由基清除能力，結(jié)果如表1所示。

從表1可以看出，組分3的A700nm值最大，即它的還原力最強，另兩個組分的抗氧化能力均比蟹抗氧化肽粗品低；3個組分的羥自由基清除率均比蟹抗氧化肽粗品高，組分1羥自由基清除率比組分3略高，組分2羥自由基清除率最低；3個組分的超氧自由基清除率均比蟹抗氧化肽粗品高，組分3超氧自由基清除率最高。結(jié)合上述抗氧化性測定結(jié)果可知，組分3的抗氧化性較強，因此確定組分3為分離純化的最終產(chǎn)物，并對組分3的純度及氨基酸組成進行測定。

2.4 蟹抗氧化肽純度鑒定

圖4 組分3的HPLC分離圖Fig.4 HPLC separation profile of subfraction No.3

從圖4可以看出，在保留時間為7.86min處，得到1個峰面積比為85.87%的洗脫峰，這說明組分3已基本得到純化。

2.5 蟹抗氧化肽的氨基酸組成

表2 組分3的氨基酸組成Table2 Amino acid compositions of subfraction No.3

從表2可以看出，蟹抗氧化肽組分3由11種氨基酸組成，具有抗氧化能力的酪氨酸、半胱氨酸和組氨酸[14-15]，占總量將近一半，含量分別為22.86%、11.38%、10.79%。

3 結(jié) 論

3.1 酶解蟹下腳料獲得的抗氧化肽經(jīng)葡聚糖凝膠G-50

與葡聚糖凝膠G-25分離純化得到3個組分，組分3的抗氧化性較強，相對分子質(zhì)量約為1096.5。

3.2 經(jīng)HPLC分析組分3已基本達到純化；氨基酸分析表明其由11種氨基酸組成，其中具有抗氧化能力的酪氨酸、半胱氨酸和組氨酸所占比例很高。

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