沈　晗,　金志剛,　孫寶國,　肖　陽,　任文雅,　史雨鑫,　廖永紅

(1. 北京工商大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院， 北京　100048；2. 北京二商金獅龍門食品有限公司， 北京　101407)

醬油的釀造過程中，經(jīng)多種微生物的協(xié)同作用，原料中復(fù)雜的大分子有機(jī)物分解和重組，并經(jīng)過復(fù)雜的生物化學(xué)作用，形成了各種活性物質(zhì)，這些物質(zhì)也一定程度地殘留在醬渣中. 王麗娟等就從醬渣餅中提取了大豆異黃酮，該物質(zhì)具有強(qiáng)烈的抗氧化作用，醬渣中另一類具有抗氧化性的物質(zhì)是蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸[1-3]. 多肽經(jīng)美拉德反應(yīng)后生成的產(chǎn)物(MRPS)因含類黑精,還原酮及N、S等雜環(huán)化合物而具有更強(qiáng)的抗氧化性，被認(rèn)為是最有前途的天然抗氧化物[4-5]. 而合成的抗氧化劑，例如丁基羥基茴香醚(BHA)、2，6-二叔丁基對甲酚(BHT)、生育酚(AH2)等具有潛在的毒副作用，許多國家已經(jīng)禁止使用，特丁基對苯二酚(TBHQ)的使用范圍和使用量也受到嚴(yán)格限控[6]. 天然的、安全的抗氧化劑越來越受到重視，有一定的抗氧化性能的多肽及其MRPS應(yīng)用于食品行業(yè)，既能減少合成抗氧化劑帶來的毒副作用，使產(chǎn)品更安全，又能節(jié)約成本. 本實(shí)驗(yàn)通過清除DPPH自由基、羥自由基的能力以及還原力，考察醬渣多肽及其MRPS的抗氧化性，國內(nèi)外尚未見到相關(guān)報(bào)導(dǎo).

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　原料與主要試劑、儀器

原料：從醬油釀造廠采得的醬渣，經(jīng)干燥、粉碎，過50目篩備用.

主要試劑：堿性蛋白酶(Alcalase)、諾維信風(fēng)味酶(Novozymes Flavorase)、DPPH、鄰二氮菲、FeSO4·7H2O、K3Fe(CN)6、三氯乙酸均為分析純.

主要儀器：DSHZ-300型恒溫水浴振蕩搖床、JXD-02型超聲提取儀、98-1-C型加熱套、WSK11-40W型電子攪拌器、T6-新世紀(jì)紫外分光光度計(jì).

1.2　制備工藝

1.2.1醬渣多肽的制備

醬渣→超聲預(yù)處理→Alcalase酶解→Novozymes Flavorase酶解→離心取清液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→冷凍干燥→醬渣多肽粗提物.

1.2.2醬渣多肽MRPS的制備

取定量醬渣多肽、葡萄糖(100%)、半胱氨酸(0.14%)于110 ℃，pH值為5時(shí)反應(yīng)80 min，產(chǎn)物冷凍干燥，即得MRPS.

1.3　測定方法

測定樣品抗氧化性的方法有很多，通常采用DPPH自由基、羥自由基清除法和Fe3+還原能力大小的測定來評價(jià)樣品的抗氧化效果.

1.3.1DPPH·清除率的測定[7]

取不同質(zhì)量濃度(0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL)的樣品0.1 mL加入1×10-4mol/L的DPPH·無水乙醇溶液2.8 mL，混合均勻后，室溫避光保存20 min，在517 nm處測定吸光度Ai；空白組以等體積無水乙醇代替樣品溶液，對照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液，并以等體積蒸餾水和無水乙醇混合液空白調(diào)零. 每個(gè)樣品做3次平行試驗(yàn)，取平均值，計(jì)算清除率.

清除率I=[1-(Ai-Aj)]/Ao×100%.

式中：Ao為對照組吸光度；Ai為樣品組吸光度；Aj為空白組吸光度.

1.3.2·OH清除率的測定[8]

取0.5 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲的無水乙醇溶液于試管中，依次加入1 mL 0.15 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH值為7.40)和0.5 mL蒸餾水，混勻；加入0.5 mL 0.75 mmol/L FeSO4·7H2O溶液，混勻，加入0.5 mL 0.01%的H2O2，于37 ℃水浴反應(yīng)60 min，在536 nm處測定吸光度A損，未損傷管以蒸餾水代替損傷管中H2O2，同等操作下測吸光值A(chǔ)未，樣品管以不同濃度樣品代替損傷管中的蒸餾水,同等操作下測吸光值A(chǔ)，每個(gè)樣品做3個(gè)平行取平均值，計(jì)算清除率。

清除率I=(A-A損)/(A未-A損)×100%.

1.3.3還原能力的測定[9]

取不同質(zhì)量濃度樣品1 mL，分別加入0.2 mol/L，pH值為6.6的磷酸鈉緩沖溶液1 mL及1% K3Fe(CN)61 mL，于50 ℃水浴反應(yīng)20 min后急速冷卻，加入10%三氯乙酸溶液1 mL，于4 000 r/min離心5 min，取上清液1 mL，加入蒸餾水2 mL及0.1% FeCl3溶液1 mL，混勻，10 min后于700 nm處測定其A值，用A值表示還原力，A值越大還原力越強(qiáng)，每個(gè)樣品做3次平行試驗(yàn)，取平均值.

2　結(jié)果與討論

2.1　醬渣多肽及其MRPS的DPPH·清除能力

DPPH·在結(jié)構(gòu)上具有苯環(huán)的共軛位阻和硝基的吸電子作用，是一種穩(wěn)定的自由基，在517 nm處有強(qiáng)吸收，當(dāng)與提供電子的待測物反應(yīng)時(shí)，生成無色產(chǎn)物，溶液褪色程度與其接受的電子數(shù)呈定量關(guān)系，褪色程度越大，則DPPH·清除率越高. 按1.2.1的方法，通過控制不同的酶解時(shí)間即可獲得不同DH的醬渣多肽，再分別按1.2.2的方法制得MRPS. 將得到的多肽及其MRPS分別配制成0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL溶液，按1.3.1的方法分別測定不同質(zhì)量濃度多肽及其MRPS樣品的DPPH·清除率，結(jié)果見圖1、圖2.

圖1　不同DH、不同濃度醬渣多肽的DPPH·清除率Fig.1　　　　DPPH· clearance of polypeptide at different DH and concentration

圖2　　　　不同DH醬渣多肽的不同濃度MRPS的DPPH·清除率Fig.2　　　　DPPH· clearance of MRPS at different DH and concentration

從圖1、圖2可知，醬渣多肽及其MRPS的DPPH·清除率隨濃度的升高逐漸增大，清除率與DH并非呈線性關(guān)系；MRPS較多肽具有更高的DPPH·清除率；質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時(shí)，DH為12.2%的醬渣多肽的清除率為73.48%，優(yōu)于殷薇薇[7]研究的麥胚蛋白酶解物(5 mg/mL時(shí)60.4%)和張尊聽[10]研究的蘆薈提取物(4 mg/mL時(shí)28.07%)的清除能力. 質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時(shí)，DH為12.2%的醬渣多肽MRPS的清除率為78.99%，相當(dāng)于0.5 mg/mL的Vc的清除率(79.23%)，高于項(xiàng)惠丹[11]等研究的酪蛋白與還原糖(40 mg/mL時(shí)72.88%)以及大豆分離蛋白與還原糖(40 mg/mL時(shí)34.98%)反應(yīng)產(chǎn)物的清除率. 所以醬渣多肽及其MRPS具有較高的清除DPPH·的能力.

2.2　醬渣多肽及其MRPS的·OH清除能力

·OH是一種氧化能力很強(qiáng)的自由基，研究表明，它是造成生物組織脂質(zhì)過氧化、核酸斷裂、蛋白質(zhì)和多糖分解的重要活性基，可以導(dǎo)致許多病理變化. 按1.3.2的方法分別測定不同DH、不同濃度的醬渣多肽及其MRPS的·OH清除率，結(jié)果見圖3、圖4.

圖3　不同DH、不同濃度的醬渣多肽·OH清除率Fig.3　　　　·OH clearance of polypeptide at different DH and concentration

圖4　　　　不同DH醬渣多肽的不同濃度MRPS的·OH清除率Fig.4　　　　·OH clearance of MRPS at different DH and concentration

從圖3、圖4可知，醬渣多肽及其MRPS的·OH清除率隨濃度的升高逐漸增大，當(dāng)DH<14.2%時(shí)，·OH清除率隨DH的升高而降低，DH>14.2%時(shí)又有所回升，MRPS較多肽具有更高的·OH清除率. 濃度為2.5 mg/mL時(shí)，DH為6.6%的醬渣多肽的·OH清除率達(dá)67.7%，優(yōu)于殷薇薇[7]研究的麥胚蛋白酶解物(3.5 mg/mL時(shí)50%)和蔣偉哲[12]報(bào)道的龍眼參(60 mg/mL時(shí)28.40%)的清除率. 同樣條件下，醬渣多肽MRPS的·OH清除率達(dá)87.4%，高于4 mg/mL時(shí)Vc(80.01%)的清除率，也高于項(xiàng)惠丹等[11]研究的酪蛋白與還原糖(80 mg/mL時(shí)83.01%)以及大豆分離蛋白與還原糖(100 mg/mL時(shí)65.32%)反應(yīng)產(chǎn)物的清除率，所以醬渣多肽及其MRPS具有較高的清除·OH的能力.

2.3　醬渣多肽及其MRPS的還原能力

通常，物質(zhì)的還原能力與抗氧化能力正相關(guān)，待測物供應(yīng)的電子使Fe3+還原為Fe2+，從而反映出體系氧化還原狀態(tài)的改變. 按1.3.3的方法分別測定不同DH的不同濃度醬渣多肽及其MRPS的吸光度值，吸光度越大還原性越強(qiáng)，結(jié)果見圖5、圖6.

圖5　不同DH、不同濃度醬渣多肽的還原力Fig.5　　　　Deoxidization capacity of polypeptide at different DH and concentration

圖6　不同DH醬渣多肽的不同濃度MRPS的還原力Fig.6　　　　Deoxidization capacity of MRPS at different DH and concentration

從圖5、圖6可知，醬渣多肽及其MRPS的還原力隨著濃度升高逐漸增大，當(dāng)DH>12.2%時(shí)，醬渣多肽還原力隨DH增大逐漸減小，當(dāng)DH>8.2%時(shí)，醬渣多肽MRPS的還原力隨DH提高逐漸增大，MRPS較多肽具有更高的還原能力. MRPS質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時(shí)，DH為12.2的醬渣多肽的還原力為0.409，優(yōu)于殷薇薇[7]研究的麥胚蛋白酶解物(5 mg/mL時(shí)0.312)，同樣條件下醬渣多肽的MRPS的還原力高于王惠英等[12]研究的L-賴氨酸與D-核糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的還原能力(2.5～15.0 mg/mL時(shí)均<0.02)，所以醬渣多肽及其MRPS具有較高的還原力.

3　結(jié)　論

不同DH時(shí)醬渣蛋白酶解產(chǎn)生的多肽組成及含量不同，所以不同DH時(shí)的醬渣多肽及其MRPS的抗氧化性也不同. 通過測定不同DH下的醬渣多肽及其MRPS的抗氧化性得知：隨著濃度升高，抗氧化性增強(qiáng)；DPPH·清除率與DH并非呈線性關(guān)系；當(dāng)DH<14.2%時(shí)，多肽及MRPS的·OH清除率均隨DH的升高而降低；醬渣多肽及其MRPS的還原力變化趨勢則有所不同，當(dāng)DH>12.2%時(shí)，醬渣多肽還原力隨DH增大逐漸減少，當(dāng)DH>8.2%時(shí)，MRPS的還原力隨DH提高逐漸增大.

醬渣多肽與麥胚蛋白酶解物、龍眼參等多肽類產(chǎn)物相比，醬渣多肽MRPS與Vc、酪蛋白和大豆蛋白與還原糖等物質(zhì)的MRPS相比，可知：醬渣多肽及其MRPS具有較強(qiáng)的抗氧化性. 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為醬渣多肽及其MRPS用作天然抗氧化劑提供了直接依據(jù)，有利于醬渣資源的綜合利用和高值化發(fā)展.