劉健楠，　汪　蘋，　尹明銳，　王　磊

(北京工商大學 化學與環(huán)境工程學院， 北京　100048)

氮元素的嚴重超標將引起水體的富營養(yǎng)化及嚴重的生態(tài)環(huán)境污染等問題，因此，加強廢水脫氮研究就顯得尤為迫切[1-2]. 作為生物脫氮技術之一的好氧反硝化工藝與傳統(tǒng)的缺氧反硝化工藝相比具有獨特優(yōu)勢[3]: 1) 細菌能在有氧條件下進行反硝化，使硝化和反硝化能夠同時在一個反應器中進行,可以大大減少占地面積和建設資金.2)硝化的產物可直接作為反硝化作用的底物，避免了硝酸、亞硝酸的積累對硝化反應的抑制，加速了硝化反硝化進程. 且反硝化釋放出的OH-可部分補償硝化反應所消耗的堿，能使系統(tǒng)中pH值相對穩(wěn)定. 3)在好氧脫氮過程中，進水中的高濃度有機物直接成為脫氮所需的外界碳源，脫氮同時解決了高COD的問題. 近年來，新的研究發(fā)現(xiàn)，有些好氧反硝化菌往往也能進行異養(yǎng)硝化，可以在有大量氧存在的條件下直接把氨氮轉化為脫氮產物而去除，異養(yǎng)硝化-好氧反硝化已逐漸成為人們的研究熱點和重點[4-6]. 目前，文獻關于具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化能力菌株的N2O控逸研究報道不多. 本研究從實驗室SBR反應器活性污泥中篩選兼具異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能的菌株，對其各種生長特性和脫氮性能、N2O逸出情況進行研究和鑒定，以期為該菌株的應用提供科學依據.

1　材料與方法

1.1　菌株來源

該菌株來源于以硝酸鹽為底物的SBR反應器(TN去除率80.0%～85.0%，CODCr去除率85%～90%)中的活性污泥.

1.2　培養(yǎng)基

溴百里酚藍(BTB)初篩培養(yǎng)基(g/L)[7]：瓊脂20，KNO31，KH2PO41，F(xiàn)eC12·6H2O 0.5，CaCl2·7H2O 0.2，MgSO4·7H2O 1，琥珀酸鈉8.5，BTB(0.1 BTB溶于10 mL乙醇)1 mL，用1 mol/L的NaOH調節(jié)pH值至7.0～7.3，121 ℃滅菌20 min，備用.

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：KNO31,KH2PO41,FeCl2·6H2O 0.05,CaCl2·7H2O 0.02,MgSO4·7H2O 1,琥珀酸鈉8.5，121 ℃滅菌20 min，備用.

DM反硝化培養(yǎng)基(g/L)[8]：KNO30.72，KH2PO41，MgSO4·7H2O 1，琥珀酸鈉2.8，調節(jié)初始pH值7.0，121 ℃滅菌20 min，備用.

硝化富集培養(yǎng)基(g/L)：(NH4)2SO40.47，KH2PO41.0，F(xiàn)eCl2·6H2O 0.5，CaCl2·7H2O 0.2，MgSO4·7H2O 1.0，檸檬酸三鈉4.08，121 ℃滅菌20 min，備用.

異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基(g/L)：(NH4)2SO40.47，琥珀酸鈉5.62，50 mL維氏鹽溶液，121 ℃滅菌20 min，備用.

維氏鹽溶液(g/L)：K2HPO45.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，NaCl 2.5，MgSO4·7H2O 2.5，MnSO4·4H2O 0.05，溶解后加水定容至1 L.

1.3　菌株的篩選與脫氮性能測定

1.3.1菌株的篩選

采用梯度稀釋法將污泥樣品稀釋至適當濃度，取0.1 mL均勻涂布于BTB培養(yǎng)基表面，置入恒溫培養(yǎng)箱，30 ℃培養(yǎng)2～3 d后，用接種環(huán)挑取使周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)藍色暈圈的單菌落，進行分離純化即為初篩菌株. 將初篩菌株接種于瓊脂斜面上，在4 ℃冰箱中保存.

1.3.2菌株的好氧反硝化性能測定

1.3.3菌株的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能和脫氮產物N2O的測定[9-10]

1.4　菌株的鑒定

1.4.1形態(tài)觀察

觀察菌落形態(tài)并進行革蘭氏染色，用掃描電鏡觀察[11]菌體形態(tài).

1.4.2生理生化鑒定

依據《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]進行生理生化測定.

1.4.3Biolog自動微生物鑒定

Biolog自動微生物鑒定系統(tǒng)[13]利用微生物對95種不同碳源的代謝情況來鑒定菌種，即各種菌形成各自特有的代謝指紋圖譜，選用四唑類物質作為菌株能否利用供試碳源的指示劑. 將菌株接種于BUG+B平板培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h，用無菌棉簽將平板上的菌體洗下，與接種液(GN/GP-IF+T)混合，制成菌懸液，用濁度計調整至20%透光率. 用8孔電動加液器將菌懸液分別加在Biolog微孔鑒定板的各孔中，每孔150 μL. 將微孔鑒定板放在37 ℃培養(yǎng)箱中，在培養(yǎng)24 h后將其置于Biolog讀數(shù)儀上與標準數(shù)據庫進行對比并讀取結果.

1.4.4菌株的分子生物學鑒定[14]

菌株的DNA提取采用細菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司). 16S rDNA基因擴增引物采用通用引物，正向引物為27f (5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)，反向引物為1492r (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，由英俊生物科技有限公司合成. PCR反應體系(50 μL)：10×PCR Buffer(含15 mmol MgCl)5 μL，dNTPs 4 μL, 引物27f和1492r各2.5 μL，雙重蒸餾水34 μL，混勻后加入DNA模板2.5 μL，Taq酶0.5 μL. PCR反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性，30 s, 52 ℃退火，80 s, 72 ℃延伸，90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸8 min. PCR產物經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析，交由天根生物科技有限公司測序. 將菌株的16S rDNA序列在GenBank核酸序列數(shù)據庫中進行序列同源性比較，通過CLUSTALX[15]、MEGA[16]等軟件進行多重序列比對分析，并以Neighbor-Joining[17]法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，分支聚類的穩(wěn)定性用Bootstrap方法進行評價.

1.5　分析方法

1.5.1水體中各項指標的測定[18]

氨氮測定采用GB 7479—87納氏試劑分光光度法，硝態(tài)氮測定采用GB 7480—87酚二磺酸紫外分光光度法，亞硝態(tài)氮測定采用GB 7493—87 N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法. 菌體量：光密度法，用721型分光光度計在600 nm處測定吸光度值. 水中CODCr采用CODCr快速測定儀(5B-1型，蘭州連華儀器有限公司)測定.

1.5.2氣體N2O的測定

該研究采用GC-TCD法測定N2O氣體, 具體操作方法為: 每隔2 h在發(fā)酵罐排氣口處用100 mL玻璃注射器緩慢勻速抽取氣體, 立即注入用高純氮清洗并抽成真空的500 mL或1 L氣袋中. 測定時用10 mL氣體樣品鎖式進樣器(美國HAMILTON公司) 從氣袋中準確抽取一定量氣體進行GC-ECD分析. 氣體N2O的測定選用的綜合色譜條件為：檢測器溫度(TD)(350 ℃)、分離柱溫度(TC)(50 ℃)、載氣流速(fC)(20 mL/min). 實驗中主要采用Varian 3800型氣相色譜儀;10mci63Ni型電子捕獲檢測器(ECD); 3 m×3 mm不銹鋼柱, 填充固體Porapak Q柱, 80/100目.

2　結果與討論

2.1　菌株的形態(tài)學特征分析

菌株WYLW-X06在平板上培養(yǎng)24 h后，形成直徑3～5 mm的圓形菌落，菌落表面粗糙、隆起，灰白色. 光學顯微鏡觀察該菌為革蘭氏陽性菌，桿菌，有芽孢. 電鏡觀察該菌呈直桿狀，大小(10～13) μm×(3～4) μm，兩端鈍圓、無鞭毛. 菌株的電鏡照片見圖1.

圖1　菌株WYLW-X06的電鏡照片(20 000×)Fig.1　Electron microscope of WYLW-X06 strain(20 000×)

2.2　菌株的生理生化鑒定結果

細菌的新陳代謝類型不同，對各種生理生化試驗的不同反應，顯示出各類菌種間酶系統(tǒng)的不同，可作為細菌分類鑒定的重要依據. 菌株WYLW-X06生理生化鑒定結果見表1. 根據形態(tài)學和生理生化特征測定結果，初步鑒定菌株WYLW-X06是芽孢桿菌屬(Bacillus.sp).

表1　菌株WYLW-X06的生理生化特征

2.3　Biolog鑒別分析

經Biolog讀數(shù)儀分析代謝指紋，菌株WYLW-X06可利用95種碳源中的44種碳源，對其他51種碳源不能利用或利用能力較弱. 與標準數(shù)據庫對比后，給出鑒定結果：該菌與蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)標準菌株的相似性指數(shù)為0.644. Biolog鑒定結果如表2.

2.4　菌株WYLW-X06的分子生物學鑒定結果

2.4.1菌株WYLW-X06的16S rDNA的PCR擴增與測序

用菌株WYLW-X06的基因組DNA作模板，利用16S rDNA通用引物(27 f和1 492 r)進行PCR擴增，得到長約1.5 kb的目的片段，擴增結果見圖2. 對擴增得到的16S rDNA片段測序，測得菌株WYLW-X06的16S rDNA總共1 440個堿基，在核酸數(shù)據GenBank (NCBI)申請的登錄號為：GU116563.

表2　菌株WYLW-X06 Biolog特征

圖2　菌株WYLW-X06的16S rDNA的PCR電泳圖Fig.2　　　　Electrophoresis map of cloning procedure of 16S rDNA from WYLW-X06

2.4.2菌株WYLW-X06的系統(tǒng)進化分析

選取GenBank數(shù)據庫中8株同源性相近的細菌與WYLW-X06構建系統(tǒng)進化樹，結果見圖3. 由圖3看出，菌株WYLW-X06與蠟狀芽孢桿菌屬相似性最高，同源性達99%，所以菌株WYLW-X06是蠟狀芽孢桿菌屬的一種. 16S rDNA鑒定結果與Biolog鑒定結果相對照，可證實菌株WYLW-X06是蠟狀芽孢桿菌.

圖3　菌株WYLW-X06的系統(tǒng)進化發(fā)育樹Fig.3　Consensus phylogenetic tree for strain WYLW-X06

2.5　菌株WYLW-X06的脫氮性能研究

2.5.1菌株WYLW-X06的好氧反硝化性能研究

以KNO3為唯一氮源，琥珀酸鈉為碳源，初始氨氮濃度為78 mg/L，C/N為15，DO為120 r/min，pH值為7.0，溫度30 ℃，連續(xù)培養(yǎng)4 d. 菌株WYLW-X06的培養(yǎng)液中氮素濃度的變化見圖4.

圖4　菌株WYLW-X06的好氧反硝化作用Fig.4　Aerobic denitrification of strain WYLW-X06

由圖4看出，培養(yǎng)液中硝基氮質量濃度由初始的78 mg/L降低到2.09 mg/L，去除率達到97.32%，總氮去除率達到96.35%. 亞硝基氮濃度一直處于很低水平. 證明菌株WYLW-X06具有良好的反硝化能力，確實是一株高效的具有好氧反硝化能力的菌株.

2.5.2菌株WYLW-X06的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能和脫氮產物N2O的研究

以(NH4)2SO4為唯一氮源，琥珀酸鈉為碳源，初始氨氮濃度為85 mg/L，COD/N為20，DO為120 r/min，pH值為7.0，溫度30 ℃，培養(yǎng)周期為58 h，取樣時間間隔為2 h. 菌株WYLW-X06的培養(yǎng)液中氮素和碳源濃度的變化見圖5.

圖5　　　　好氧條件下菌株WYLW-X06對溶液中氨氮和碳源濃度變化的影響Fig.5　　　　Effect of strain WYLW-X06 on nitrogen and carbon source concentration in the denitrification culture medium under aerobic incubation

由圖5看出，在發(fā)酵罐培養(yǎng)，實驗結束時氨氮去除率達97.19%，總氮去除率96.63%，脫氮效果良好. 在培養(yǎng)過程中，從4h開始，OD600持續(xù)上升，56 h時達到最大值0.838. 同時僅能檢測出少量硝基氮和亞硝基氮，說明菌株既進行了硝化作用，同時也進行了好氧反硝化作用. 值得關注的是，在菌株進行脫氮的同時，對培養(yǎng)液中碳源的消耗和利用也十分顯著. CODCr從初始的1 565.20 mg/L降到培養(yǎng)結束時的165.6 mg/L，減少了1 399.6 mg/L，COD去除率達89.4%. CODCr的減少一方面是由于部分有機物被微生物分解而提供能量和被微生物利用合成了新的細胞物質所致，另一方面，大部分CODCr在反硝化階段作為碳源被微生物直接利用了.

3　結　論

1)采用極限稀釋和BTB培養(yǎng)基篩選的方法，并通過硝化-反硝化性能測定從味精廢水末端處理系統(tǒng)的活性污泥中篩選出一株高效異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細菌WYLW-X06. 通過形態(tài)特征觀察、生理生化特征測定、Biolog鑒定，以及16S rDNA序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定菌株WYLW-X06是蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus).

2)在好氧條件下，異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌WYLW-X06能夠高效脫氮，且生長適應性強. 在發(fā)酵罐中對菌株WYLW-X06進行擴大培養(yǎng)后，其氨氮去除率為97.19%，且反應過程中僅檢測出少量的亞硝基氮積累. 該菌株的環(huán)境適應能力提高，硝化作用啟動迅速，具有完整的脫氮酶系統(tǒng)，可進行從氨氮→硝基氮→亞硝基氮→脫氮氣體產物這一完整的硝化-反硝化過程，同時該菌株產生的N2O是微量的，可實現(xiàn)N2O生物控逸的目的. 因此該菌株具有潛在工程應用價值.

3)作為細菌的鑒定手段，將Biolog系統(tǒng)與16S rDNA序列分析方法結合可以獲得較可靠的鑒定結果. 兩者相互驗證，相互補充，提高了工作效率和結果的準確性，具有良好的可操作性.