張偉光, 梁繼宏, 蔡有杰， 肖英慧， 呂 君

(1.齊齊哈爾大學(xué) 化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾大學(xué) 圖書館，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.齊齊哈爾大學(xué) 應(yīng)用技術(shù)學(xué)院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

克拉霉素(clarithromycin) 是14 元環(huán)半合成紅霉素衍生物, 化學(xué)名為6-O-甲基紅霉素[1], 對呼吸道感染，皮膚及軟組織感染，由鳥型分支桿菌或細胞內(nèi)分支桿菌引起的局部感染有很好的治療效果[2]. 克拉霉素的作用機制是通過阻礙細胞核蛋白50S亞基的聯(lián)結(jié)，抑制蛋白合成而產(chǎn)生抑菌作用，服用后容易出現(xiàn)腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐等胃腸道反應(yīng)，血清氨基轉(zhuǎn)換酶短暫升高. 用大豆磷脂等膜材制備的克拉霉素脂質(zhì)體，可以克服以上缺點，可以使藥物具有定向分布的靶向性特征，能降低藥物毒性,還能降低藥物的消除速度,延長藥物作用時間[3].

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

克拉霉素對照品，中國藥品生物制品檢定所； 膽固醇，分析純，上海政翔化學(xué)試劑研究所；粉狀高純大豆磷脂(自制)；克拉霉素，江西匯仁藥業(yè)有限公司. 氯仿、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等為分析純，乙腈為色譜純.

透析袋(截流分子量8 000～14 000)，北京經(jīng)科宏達生物技術(shù)有限公司；微濾膜(0.45 μm截留分子量14 000)，大連依利特分析儀器公司；P230型高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器公司；1810-B型石英自動雙重純水蒸餾器，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-IIIB型循環(huán)水真空泵，浙江臨海市精工真空設(shè)備廠.

1.2 脂質(zhì)體的制備

稱取一定比例的粉狀高純大豆磷脂、膽固醇、維生素E和20 mg克拉霉素置于150 mL梨形瓶中，加入一定量的氯仿溶解，進行減壓蒸餾除去溶劑，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使之成為均勻薄膜；再加入一定量的磷酸鹽緩沖溶液及少量的山梨醇，在水浴中常壓旋轉(zhuǎn)30 min，形成乳白色懸浮液，用微孔膜過濾，然后放在冰箱中冷凍，冷凍后取出在室溫下融化，融化完畢后，充分振蕩，反復(fù)凍融3次；置冰箱中冷藏保存.

1.3 克拉霉素脂質(zhì)體含量測定

1.3.1檢測波長的確定

配制克拉霉素標準品的乙腈溶液，在190～900 nm范圍內(nèi)進行紫外掃描，見圖1. 通過紫外吸收圖譜可見，它的最大吸收波長在203.62 nm處，所以在測量克拉霉素含量時，紫外檢測波長選在205 nm處.

圖1 克拉霉素的紫外吸收圖譜Fig.1 UV spectra of clarithromycin

1.3.2標準曲線的繪制

參照文獻[4]采用反相高效液相色譜法測定克拉霉素含量. 色譜條件：色譜柱Hypersil ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，大連依利特分析儀器公司). 流動相：乙腈與0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(體積比為70∶30)，用稀磷酸調(diào)節(jié)pH值至4.8，流速1.0 mL/min. 檢測波長205 nm，進樣量20 μL，柱溫20 ℃.

精密稱取克拉霉素標準品25 mg，置于25 mL容量瓶中，先用5 mL乙腈溶解，再加流動相稀釋至刻度. 精密吸取克拉霉素標準品適量，用流動相稀釋成含克拉霉素分別為10，20，40，80，160，200 mg/L的一系列標準溶液. 在流動相為乙腈和磷酸鹽緩沖液的色譜條件下量取以上溶液各20 μL注入液相色譜儀中，記錄色譜圖. 以克拉霉素面積(A)對濃度(c)進行線性回歸，得回歸方程:A=1 256.27+20 169.39c，r=0.999 7，結(jié)果表明，克拉霉素在10～200 mg/L內(nèi)濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系. 精密吸取質(zhì)量濃度為20 mg/L標準溶液20 μL，重復(fù)進樣6次，測量峰面積，RSD為0.79%.

1.3.3樣品中含克拉霉素總的質(zhì)量及包封率的測定[5]

在測定樣品中含克拉霉素總的質(zhì)量時，選擇無水乙醇作為破乳介質(zhì)，可使混懸液變成澄清透明. 精密吸取克拉霉素脂質(zhì)體混懸液1.0 mL置于10 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋并定容至刻度，搖勻后過濾得濾液. 在上述色譜條件下移取20 μL注入液相色譜儀中，記錄峰面積，代入標準曲線計算得到樣品中含克拉霉素總的質(zhì)量. 利用透析袋采用反透析法來分離脂質(zhì)體和未封包的克拉霉素，代入標準曲線中測得未封包的克拉霉素量.

2 結(jié)果與討論

2.1 水合介質(zhì)對包封率的影響

按1.2中方法進行克拉霉素脂質(zhì)體的制備，稱取一定比例的粉狀高純磷脂、膽固醇、維生素E和20 mg克拉霉素置于150 mL梨形瓶中，將稱量物置于圓底燒瓶中；加入一定量的氯仿溶解，進行減壓蒸餾除去溶劑，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使之成為均勻薄膜；再分別加入0.9%NaCl溶液、5%葡萄糖注射液、pH值為4.8的磷酸鹽緩沖溶液，考查不同水合介質(zhì)對包封率的影響，見圖2. 由圖2可以看出，加入適量的水合介質(zhì)有助于克拉霉素脂質(zhì)體的形成，但過量的水合介質(zhì)不利于脂質(zhì)體的形成. 用磷酸鹽緩沖溶液進行水合形成的克拉霉素脂質(zhì)體，其包封率較高.

圖2 水合介質(zhì)對包封率的影響Fig.2 Effect of hydration medium content on entrapment efficiency

2.2 凍融次數(shù)對包封率的影響

按1.2方法制備克拉霉素脂質(zhì)體，只改變脂質(zhì)體懸浮液凍融次數(shù)，其他條件保持不變. 將所制得的脂質(zhì)體，冰箱冷凍后室溫融化，重復(fù)1，2，3，4，5次，實驗結(jié)果如圖3. 由圖3可知，克拉霉素脂質(zhì)體經(jīng)冰箱冷凍后，可增大脂質(zhì)體的包封率，但凍融次數(shù)超過3次后，包封率增大不明顯，所以凍融次數(shù)選在3次.

圖3 凍融次數(shù)對包封率的影響Fig.3 Effect of freezing and thawing times on entrapment efficiency

2.3 透析平衡時間的確定

利用透析袋采用透析法來分離脂質(zhì)體和未封包的克拉霉素. 在選擇透析介質(zhì)時考慮使用不同濃度的乙醇水溶液. 但乙醇又對脂質(zhì)體有破壞作用，故應(yīng)避免使用高濃度的乙醇. 實驗中發(fā)現(xiàn)15%乙醇溶液能將游離克拉霉素完全溶解，且又在平衡時間內(nèi)不能造成脂質(zhì)體的滲漏. 精密量取脂質(zhì)體混懸液3 mL置于100 mL燒杯中，用15%的乙醇溶液稀釋至刻度. 再精密量取15%的乙醇溶液3 mL于已處理的透析袋內(nèi)，把透析袋浸入上述經(jīng)稀釋的脂質(zhì)體混懸液中，同時以磁力攪拌儀攪拌. 透析過程中，分別于0,1,3,5,7,9 h吸取20 μL透析液注入液相色譜儀測定，發(fā)現(xiàn)5 h即可達到透析平衡，為保證每次透析完全而脂質(zhì)體不滲漏，將透析時間定為6 h. 實驗結(jié)果見圖4.

圖4 透析平衡時間的確定Fig.4 Determination of dialysis equilibrium time

3 結(jié) 論

制備脂質(zhì)體的方法較多，但其包封率低、穩(wěn)定性差. 采用薄膜冷凍法制備了克拉霉素脂質(zhì)體，以高效液相色譜法為分析手段，采用反透析法測定克拉霉素脂質(zhì)體的包封率，并確定了透析平衡時間，討論了水合介質(zhì)和凍融次數(shù)對包封率的影響. 該制備方法得到的克拉霉素脂質(zhì)體具有較高的包封率，不易滲漏，穩(wěn)定性好. 克拉霉素脂質(zhì)體的性質(zhì)及應(yīng)用效果正在研究中.