李勇如， 李秀婷， 孫寶國， 宋煥祿， 呂躍鋼， 宋紅霞

(北京工商大學 化學與環(huán)境工程學院/食品添加劑與配料北京市高校工程研究中心， 北京 100048)

隨著木聚糖酶在實際生產(chǎn)中的應用越來越多，巨大的經(jīng)濟效益和社會效益促使人們越來越關注木聚糖酶的研究及工業(yè)化生產(chǎn). 目前研究發(fā)現(xiàn)可以產(chǎn)生木聚糖酶的微生物來源廣泛、種類多，已報道的能產(chǎn)木聚糖酶的微生物有細菌以及霉菌等[1]. 有關研究發(fā)現(xiàn)米曲霉能夠產(chǎn)生木聚糖酶，但是對于米曲霉產(chǎn)木聚糖酶的深入研究還較少，也較少有關于米曲霉產(chǎn)木聚糖酶培養(yǎng)條件的報道. 目前木聚糖酶在食品、飼料等對酶安全性要求高的工業(yè)中應用非常廣泛. 米曲霉是一種安全性高，無致病性，應用成熟的微生物菌株，在國內(nèi)工業(yè)化釀造加工中應用非常廣，如醬油釀造，釀酒，制曲等；也可用于生產(chǎn)各種酶制劑、有機酸、糖化飼料、益生素等[2]. 米曲霉發(fā)酵加工的產(chǎn)品及食品對人類或動物具有一定的保健功效[3]. 如能提高米曲霉產(chǎn)木聚糖酶的能力，一方面可以減少生產(chǎn)成本；另一方面可以對其發(fā)酵產(chǎn)生的木聚糖酶進行深入研究并能夠比較放心的應用于食品、醫(yī)藥、飼料等工業(yè)加工中. 另外，利用木聚糖做碳源進行液體發(fā)酵來生產(chǎn)木聚糖酶，酶的生產(chǎn)成本較高[4]. 我國具有豐富的玉米芯、甘蔗渣、小麥麩、秸稈，棉籽殼等富含半纖維素類自然資源的農(nóng)林廢棄物，長期以來未受到充分重視和開發(fā)利用. 如能將其用于木聚糖酶的生產(chǎn)，不僅可以取得巨大的經(jīng)濟效益，還可以處理農(nóng)林廢料，變廢為寶，保護環(huán)境，加快農(nóng)業(yè)發(fā)展，在一定程度上解決三農(nóng)問題，提高我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的能力. 本文在液體發(fā)酵條件下對實驗室保藏的菌株米曲霉M-9，利用農(nóng)業(yè)廢棄物產(chǎn)木聚糖酶的條件及特點進行了探討.

1 材料與方法

1.1 菌 株

米曲霉(Aspergillusoryzae)M-9，運用透明圈法從王致和集團公司提供的米曲霉滬釀3.042的曲精中篩選分離而來，以PDA斜面培養(yǎng)基30～32 ℃恒溫培養(yǎng)并保存.

1.2 試 劑

樺木木聚糖：購于Sigma公司；玉米芯：購自北京郊區(qū)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.3 儀 器

可見分光光度計，棱光技術有限公司；恒溫搖床，中科院武漢科學儀器廠.

1.4 菌種培養(yǎng)

菌種保藏斜面培養(yǎng)基(各成分含量為質(zhì)量分數(shù))：玉米芯木聚糖1%、土豆20%、瓊脂2%. 121 ℃下滅菌20 min.

平板培養(yǎng)基(各成分含量為質(zhì)量分數(shù))：玉米芯木聚糖1%、 瓊脂2%、 酵母浸膏0.3%、 蛋白胨0.5%、NaNO30.2%、KH2PO40.6%、MgSO4·7H2O 0.05%、FeSO40.01%、 KCl 0.01%. 121 ℃下滅菌20 min.

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基(各成分含量為質(zhì)量分數(shù))：玉米芯木聚糖2%、酵母浸膏0.8%、蛋白胨1%、NaNO30.2%、KH2PO40.4%、MgSO4·7H2O 0.05%、FeSO40.005%、KCl 0.05%. 121 ℃下滅菌20 min.

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：250 mL錐形瓶裝液量50 mL，接入1 cm2見方的平板培養(yǎng)基上生長4 d的孢子，30 ℃條件下200 r/min培養(yǎng)，取樣備用.

1.5 木聚糖酶活力的測定

木聚糖酶活力的測定參照DNS法[5]：0.1 mL適當稀釋的酶溶液，加入到0.9 mL用0.05 mol/L、pH值為5.3檸檬酸鈉緩沖液配制的濃度1%樺木木聚糖底物溶液中，55 ℃反應5 min,加入1 mL DNS溶液終止反應后在540 nm測定吸光度值，同時以木糖標準液(10 μmol/ mL)作標準曲線. 木聚糖酶的活力單位(U)定義為：在上述條件下，每分鐘水解木聚糖生成1 μmol木糖所需要的酶量.

1.6 蛋白質(zhì)含量的測定

蛋白定量采用Lowry方法[6]，以牛血清蛋白為標準.

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源對菌株產(chǎn)酶的影響

2.1.1碳源種類對菌株產(chǎn)酶的影響

碳源是影響高效生產(chǎn)木聚糖酶的關鍵因素之一，它在微生物生長過程中為機體提供維持生命活動所必需的能源物質(zhì)，并在產(chǎn)木聚糖酶過程中作為誘導底物. 圖1是以幾種糖類作為碳源對菌株M-9產(chǎn)生木聚糖酶的影響情況. 由圖1可知，米曲霉在發(fā)酵過程中檢測到的木聚糖酶活力很低，說明盡管米曲霉能夠利用實驗中的幾種單糖或多糖進行細胞生長，但這些碳源卻不宜于誘導菌株木聚糖酶的合成及分泌，抑或是這些碳源在菌株生長產(chǎn)酶過程中起了抑制作用. 木聚糖酶的誘導是復雜的，誘導水平也因微生物的不同而相差很大[7]. 從圖1還可看出，纖維素、乳糖和木糖對菌株M-9產(chǎn)木聚糖酶起到了一定的誘導作用，約為葡糖糖、蔗糖和麥芽糖誘導水平的2～4倍. Smith和Wood[8]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖幾乎對木聚糖酶的誘導不起作用，而木糖卻具有一定的誘導效果.

圖1 碳源對菌株酶活力的影響Fig.1 Effect of various carbon sources on xylanase production

2.1.2不同來源木聚糖對菌株產(chǎn)酶的影響

很多底物可以誘導微生物細胞產(chǎn)生木聚糖酶并分泌到胞外，其中誘導效果較好的是各種來源的木聚糖[9]. 圖2考察了不同來源木聚糖對菌株產(chǎn)木聚糖酶活力的影響. 從圖2可看出，玉米芯水不溶性木聚糖的誘導效果最好，木聚糖酶活力為458.10 U/mL，而玉米芯水溶性木聚糖誘導產(chǎn)木聚糖酶能力較差，這主要是由于玉米芯水不溶性木聚糖的組成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)比較有利于誘導菌株M-9合成分泌木聚糖酶. 燕麥全溶性木聚糖的誘導效果較差，菌株M-9產(chǎn)生的木聚糖酶活力僅為99.95 U/mL.

圖2 不同來源木聚糖對菌株酶活力的影響Fig.2 Effect of different xylans on xylanase production

2.1.3不同農(nóng)業(yè)廢棄物對菌株產(chǎn)酶的影響

采用玉米芯、麥皮、麩皮、甘蔗渣、棉籽殼、豆桿、稻殼作為單一碳源進行菌株產(chǎn)木聚糖酶的發(fā)酵試驗，比較不同碳源對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖3. 圖3結(jié)果顯示，玉米芯為碳源時，發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶活力顯著高于其他種類的農(nóng)業(yè)廢棄物，酶活力達到360.81 U/mL. 玉米芯、棉籽殼等的產(chǎn)酶效果明顯優(yōu)于葡萄糖、蔗糖等碳源，廢棄物中含有的大量纖維素和半纖維素對木聚糖酶的產(chǎn)生有一定誘導作用，其中木聚糖含量較高的玉米芯粉作碳源時產(chǎn)酶效果最好. 翟倩等[10]研究得到玉米芯粉誘導菌株產(chǎn)木聚糖酶活性226.53 U/mL. 由于不同種類的農(nóng)業(yè)廢棄物所具有的木聚糖的化學結(jié)構(gòu)和性質(zhì)及含量不同，微生物利用的程度不同，因而菌株利用農(nóng)業(yè)廢棄物產(chǎn)木聚糖酶的能力存在差異. Battan等[11]認為，高活性木聚糖酶的產(chǎn)生可能是纖維質(zhì)原料中除木聚糖外的成分誘導并分泌了其它半纖維素酶，而這些酶與木聚糖酶協(xié)同作用的結(jié)果. 實驗表明盡管木聚糖的誘導效果好于農(nóng)業(yè)廢棄物，但本實驗中玉米芯粉作碳源時菌株產(chǎn)木聚糖酶活是玉米芯水不溶性木聚糖作為碳源時的78.8%，說明玉米芯對菌株M-9產(chǎn)木聚糖酶也能起到良好的誘導作用，該菌株能較好地利用農(nóng)業(yè)廢棄物.

圖3 農(nóng)業(yè)廢棄物對菌株酶活力的影響Fig.3 Effect of agricultural wastes on xylanase production

2.1.4碳源質(zhì)量分數(shù)對菌株產(chǎn)酶的影響

圖4 碳源質(zhì)量分數(shù)對菌株酶活力的影響Fig.4 Effect of concentration of carbon source on xylanase production

考察不同玉米芯碳源質(zhì)量分數(shù)對菌株產(chǎn)酶能力的影響，實驗結(jié)果如圖4. 從圖4可知，當碳源質(zhì)量分數(shù)達到4%時，木聚糖酶活力達到最高(586.80 U/mL)；隨后，碳源質(zhì)量分數(shù)增加，木聚糖酶活力反而開始下降. 當碳源質(zhì)量分數(shù)較低時，培養(yǎng)基營養(yǎng)不充足，不利于菌體生長繁殖及產(chǎn)酶；碳源質(zhì)量分數(shù)過高，固形物過多，影響通氧量，引起細胞溶氧不足，不僅影響微生物的生長，而且不利于原料的高效合理利用. Battan等[11]報道，BacilluspumilusASH木聚糖酶的活力隨著碳源質(zhì)量分數(shù)的增大(0.25%～2.0%)而提高，并隨著碳源質(zhì)量分數(shù)進一步加大而減小，這是由于碳源在搖瓶發(fā)酵過程中形成了較厚的懸浮物，使得碳源混合不均勻而不利于微生物利用.

2.1.5碳源粒度對菌株產(chǎn)酶的影響

碳源種類和質(zhì)量分數(shù)確定后，考察碳源粒度對菌株產(chǎn)木聚糖酶活力的影響，實驗結(jié)果如圖5. 從圖5可以看出，隨著碳源粒度的減小，產(chǎn)木聚糖酶活力逐漸增高，在200目時達到最大值663.49 U/mL. 碳源粒度的大小是影響菌株向胞外分泌酶的重要因素，因為較小的粒度擁有較大的比表面積[12]，則菌株與誘導物結(jié)合的面積相對較大，利于菌株發(fā)酵產(chǎn)酶，木聚糖酶產(chǎn)量相對較高. 但碳源粒度過小，菌株發(fā)酵產(chǎn)生木聚糖酶的量也有一定程度的下降.

圖5 碳源粒度對菌株酶活力的影響Fig.5 Effect of partical sizes of carbon source on xylanase production

2.2 氮源對菌株產(chǎn)酶的影響

2.2.1氮源種類對菌株產(chǎn)酶的影響

酶誘導物和酶蛋白質(zhì)前體物質(zhì)共同調(diào)控木聚糖酶的合成，其中酶誘導物主要是可利用的碳源，而酶蛋白質(zhì)的前體主要來自于氮源，氮源和碳源的類型和性質(zhì)會影響酶的合成和分泌. 最佳碳源確定后，以不同的有機氮源和無機氮源作為唯一氮源，質(zhì)量分數(shù)仍為2.0%，來考察氮源對木聚糖酶合成的影響，結(jié)果如表1. 由表1可知，菌株利用兩種銨鹽所產(chǎn)木聚糖酶活力都很低，這是因為銨鹽被分解利用使發(fā)酵液的pH值大幅下降，改變了菌株生長的緩沖體系，而不利于菌株的生長和產(chǎn)酶. 在有機氮源中，以酵母提取物為氮源時菌株所產(chǎn)木聚糖酶活性最高，酶活力達780.33 U/mL. 大豆蛋白胨次之. 氮源對微生物產(chǎn)酶的影響比較復雜，對不同微生物的作用不同. Battan等[11]認為微生物利用有機氮源產(chǎn)木聚糖酶情況比用無機氮源好得多. 不過也有報道無機氮源也能利于某些微生物產(chǎn)木聚糖酶，如Xu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，無機氮源更有利于Pseudomonassp. WLUN024產(chǎn)生并分泌木聚糖酶.

表1 氮源種類對菌株酶活力的影響Tab.1 Effect of various nitrogen sources on xylanase production

2.2.2復合氮源對菌株產(chǎn)酶的影響

選擇最適的兩種氮源，改變復合氮源比例，考察復合氮源對菌株產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如表2. 試驗結(jié)果表明：酵母提取物：大豆蛋白胨質(zhì)量比為3∶2時，產(chǎn)木聚糖酶活力達到最高為738.45 U/mL.

表2 復合氮源對菌株酶活力的影響Tab.2 Effect of compound nitrogen sources on xylanase production

2.3 培養(yǎng)基初始pH值對菌株產(chǎn)酶的影響

由于微生物對生長環(huán)境的酸堿性要求不同，因而培養(yǎng)基初始pH值對菌株產(chǎn)酶的影響很大，發(fā)酵過程中選擇適宜的pH值非常重要. 在優(yōu)化碳氮源的基礎上，以1 mol/L HCl或NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值范圍為4.5～8.0，培養(yǎng)基初始pH對菌株產(chǎn)酶的影響如圖6. 從圖6可以看出，當初始pH值為7.5時，菌株的木聚糖酶活力達到最高，為775.78 U/mL；之后，pH繼續(xù)升高，酶活下降較快，pH值為8時的酶活是pH值為7.5時的65.6%. 當培養(yǎng)基的初始pH值變化時，組成型的糖苷酶與透過酶活性中心的氨基酸的解離狀態(tài)會發(fā)生改變，影響這些酶的活性以及質(zhì)膜和細胞膜的通透性，木聚糖酶基因的轉(zhuǎn)錄受到阻遏，酶的合成受到影響[14]. 李秀婷等[15]報道，在米曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件及酶活力研究中米曲霉產(chǎn)生木聚糖酶的最佳培養(yǎng)基初始pH值范圍屬于中性偏堿，這與本實驗結(jié)果類似.

圖6 初始pH值對菌株酶活力的影響Fig.6 Effect of the initial medium pH on xylanase production

2.4 培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酶的影響

圖7 培養(yǎng)溫度對菌株酶活力的影響Fig.7 Effect of cultivation temperature on xylanase production

上述條件優(yōu)化后，采用不同溫度對菌株進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，考察不同溫度對菌株M-9產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖7. 由圖7可知，菌株在30 ℃培養(yǎng)時，木聚糖酶的產(chǎn)量達到最高，木聚糖酶活力為775.78 U/mL. 溫度為25 ℃或35 ℃時，酶活力也較高，分別是最高酶活力的77.2%和64.6%. 在45 ℃培養(yǎng)時，酶活僅為最高酶活的12.5%，此時觀察發(fā)酵液發(fā)現(xiàn)，菌體生長稀疏，三角瓶壁附著的菌絲體較少. 過高的溫度會造成細胞內(nèi)的活性物質(zhì)發(fā)生變性，嚴重抑制微生物的代謝循環(huán).

2.5 轉(zhuǎn)速對菌株產(chǎn)酶能力的影響

在碳氮源、pH值、溫度都確定的條件下，通過調(diào)節(jié)不同的轉(zhuǎn)速，考察轉(zhuǎn)速對菌株M-9產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖8. 由圖8可知，當轉(zhuǎn)速控制在200 r/min時，菌株產(chǎn)木聚糖酶能力最強，產(chǎn)生的木聚糖酶活力達到775.78 U/mL. 較低轉(zhuǎn)速條件下(160 r/min)菌株酶活力為最高值的17.5%；較高轉(zhuǎn)速條件下(240 r/min)，酶活力為最高值的27.8%. 當轉(zhuǎn)速較小時，發(fā)酵液中溶氧量不足，抑制了菌絲的生長，不利于菌株產(chǎn)木聚糖酶；當轉(zhuǎn)速較高時，菌絲受到的剪切力作用過大，菌絲體過于短小細碎，菌絲生長受到一定影響，導致酶產(chǎn)量下降[16]. 搖床轉(zhuǎn)速對菌株木聚糖酶的產(chǎn)生具有較大影響.

圖8 轉(zhuǎn)速對菌株酶活力的影響Fig.8 Effect of rotation rate on xylanase production

2.6 添加表面活性劑對菌株產(chǎn)酶的影響

圖9 添加表面活性劑對菌株酶活力的影響Fig.9 Effect of various additives on xylanase production

在碳氮源、pH值、溫度、轉(zhuǎn)速都確定的條件下，考察添加不同種類表面活性劑(0.2%)對菌株M-9產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖9. 由圖9可知，吐溫60的添加促進了木聚糖酶的產(chǎn)生，酶活力是對照的102.6%. 表面活性劑乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)的添加對菌株產(chǎn)木聚糖酶起了較強的抑制作用，酶活力分別為對照的20.7%,2.2%和24.1%. Battan等[11]在BacilluspumilusASH的培養(yǎng)基中添加體積分數(shù)為0.2%的橄欖油，木聚糖酶活力提高到原來的2倍，并認為這類物質(zhì)改變了細胞膜的通透性，從而促進了木聚糖酶的胞外分泌.

2.7 優(yōu)化后米曲霉菌株M-9的產(chǎn)酶曲線和生長情況

在最佳條件下，米曲霉菌株M-9液體搖瓶發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的歷程如圖10. 在發(fā)酵過程中，觀察發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液在第1天以后變得黏稠，而酶活力低，說明菌株還處于生長期，第2天粘稠度增大，酶活力也提高，在第3天酶活迅速升高，在第5天酶活力達到頂峰，為795.93 U/mL，第6天略有下降. 在此過程中，發(fā)酵液中蛋白含量隨著發(fā)酵時間的延續(xù)發(fā)生相應的變化，其趨勢與木聚糖酶的變化基本一致：發(fā)酵液的蛋白含量隨酶活力的上升而增加.

圖10 產(chǎn)酶過程曲線Fig.10 Fermentation time course of xylanase production

發(fā)酵條件優(yōu)化后，菌株產(chǎn)酶提前一天達到最高酶活，表明優(yōu)化后的培養(yǎng)條件比較適宜菌株M-9產(chǎn)木聚糖酶，優(yōu)化后酶活力為795.93 U/mL，是優(yōu)化前酶活力的2.2倍.

3 結(jié) 論

本論文研究了菌株M-9產(chǎn)木聚糖酶的培養(yǎng)條件，分別對其生長所必需的碳源、氮源、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基初始pH值等條件進行了優(yōu)化. 由實驗得出，菌株M-9利用農(nóng)業(yè)廢棄物發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的最佳培養(yǎng)條件為：最適碳源為粒度小于0.08 mm的玉米芯粉質(zhì)量分數(shù)4%，最適復合氮源是質(zhì)量分數(shù)1.2%的酵母提取物與0.8%的大豆蛋白胨，最適培養(yǎng)基初始pH值為7.5，最適培養(yǎng)溫度為30 ℃，最佳轉(zhuǎn)速為200 r/min. 添加質(zhì)量分數(shù)0.2%的吐溫60對菌株產(chǎn)酶有促進作用. 在優(yōu)化后的最適產(chǎn)酶條件下培養(yǎng)5 d，木聚糖酶活力達到795.93 U/mL. 優(yōu)化后酶活795.93 U/mL是優(yōu)化前酶活力的2.2倍.