林美光 王佩顯 崔讓莊 曹 麗 王偉強(qiáng) 張 麗 陳 倩 趙福梅

長期過量飲酒會導(dǎo)致左心室功能障礙，并且最終可能會引發(fā)充血性心力衰竭。有文獻(xiàn)報道高達(dá)36%的擴(kuò)張型心肌病患者是由過量飲酒引起的[1]。酒精性心肌病的表現(xiàn)主要有心臟肥大、心肌纖維化、心肌纖維結(jié)構(gòu)損害，早期舒張功能損害至晚期收縮功能下降，并且高血壓和中風(fēng)的風(fēng)險也增加。目前酒精性心肌病的發(fā)病機(jī)制還不十分清楚[2]。在本研究中，乙醇喂養(yǎng)大鼠16周后檢測心臟功能，尤其是左心室舒張功能，同時測量左心室心肌膠原含量的變化，探討兩者的相關(guān)關(guān)系，以期揭示乙醇所致心臟功能損害的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料24只8周齡雄性Wistar大鼠購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，無特定病原體（SPF級），平均體質(zhì)量為（269.83±9.08）g，隨機(jī)分為對照組（12只）和乙醇組（12只）。乙醇（46%V/V）購自天津市直沽釀酒廠。羥脯氨酸試劑盒購自南京建成生物工程研究所第一分所。試劑Trizol購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 慢性乙醇喂養(yǎng)大鼠 所用實驗大鼠均給予標(biāo)準(zhǔn)飼料（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物研究所，北京）喂養(yǎng)。對照組和乙醇組分別給予水和乙醇溶液作為飲料，喂養(yǎng)16周。每天記錄實驗組大鼠攝入乙醇的量。最后計算大鼠平均每天每千克體質(zhì)量攝入乙醇的量。實驗?zāi)┢趯?組大鼠進(jìn)行超聲心動圖檢查，最后處死大鼠并取出心臟，應(yīng)用羥脯氨酸測試試劑盒測定心肌羥脯氨酸含量，RT-PCR檢測心?、裥湍z原、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)。

1.2.2 經(jīng)胸超聲心動圖（TTE）檢查 儀器為美國Acuson公司Sequoia512型彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率為8 MHz，配備組織多普勒成像（tissue Doppler imaging,TDI）和心臟功能測定軟件包及同步Ⅱ?qū)碾妶D。大鼠以0.4%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射，麻醉滿意后，固定、去毛，行TTE檢查。于心尖四腔面行多普勒頻譜檢測，獲取二尖瓣E峰峰速度（E）、左室等容舒張時間（IVRT）。隨后啟動TDI速度模式，取心尖四腔面，脈沖多普勒取樣容積置于二尖瓣內(nèi)環(huán)，描記其運動頻譜，測量E峰峰速度（Ea）、A峰峰速度（Aa）及Ea/Aa比值。測量采取3～5個心動周期測量的數(shù)據(jù)，取其平均值。由于鼠科動物心率快，M型曲線及多普勒血流頻譜掃描速度設(shè)置>100 mm/s。所有圖像數(shù)據(jù)存盤，以便分析。超聲測量參照美國超聲心動圖學(xué)會制定的標(biāo)準(zhǔn)[3]。

1.2.3 心肌羥脯氨酸含量的測定 依照羥脯氨酸試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 RT-PCRTRIZOL法提取心肌細(xì)胞總RNA，以MMLV逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，產(chǎn)物進(jìn)行目的基因及內(nèi)參基因的PCR擴(kuò)增。全部引物設(shè)計均經(jīng)GenBank查對無誤后進(jìn)行合成。Ⅰ型膠原上游引物為5′-CCCTGAAGTCAGCTGCATAC-3′，下游引物為5′-ATATTTTTCTGGGCAGAAAG-3′，擴(kuò)增長度196 bp；內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）上游引物為5′-AGTCCATGTCATCACTGCCAC-3′、下游引物為5′-TGGGAG TTGCTGTTGAAGTCAC-3′，擴(kuò)增長度342 bp。Ⅲ型膠原上游引物為5′-CCACCCTGAACTCAAGAGTGG-3′，下游引物為5′-CCATCCTCTAGAACTGTGTAAGTG-3′，擴(kuò)增長度444 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物為5′-ACAAAGTGGACATTGTTGCC-3′，下游引物為5′-AAACATGGTGAAGACGC-3′，擴(kuò)增長度242 bp。Ⅰ型膠原的PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30個循環(huán)。Ⅲ型膠原的PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30個循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)過2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察，凝膠成像分析儀進(jìn)行半定量分析，以Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原基因與GAPDH基因的灰度比值表示Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原mRNA的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行兩樣本均數(shù)比較的t檢驗，兩變量間應(yīng)用Pearson相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

乙醇組大鼠平均攝入乙醇量（5.00±0.82）g/（kg·d）。

2.1 2組大鼠左室舒張功能參數(shù)的比較 與對照組相比，乙醇組二尖瓣E峰值降低、IVRT延長，二尖瓣內(nèi)環(huán)TDI舒張早期速度Ea降低，舒張晚期速度Aa增高（P<0.05或P<0.01）。對照組的Ea/Aa比值>1，而乙醇組<1，2組Ea/Aa比值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表1。

表1 2組大鼠左室舒張功能參數(shù)比較 （±s）

表1 2組大鼠左室舒張功能參數(shù)比較 （±s）

*P＜0．05，**P＜0．01

組別對照組乙醇組t n 12 12 E(m/s)0.83±0.06 0.71±0.12 2.869**IVRT(ms)25.08±4.72 33.50±5.68 3.948**Ea(cm/s)8.30±1.58 6.33±2.14 2.568*Aa(cm/s)6.54±2.65 12.64±6.45 3.027**Ea/Aa 1.35±0.31 0.57±0.25 6.692**

2.2 2組大鼠心肌羥脯氨酸含量和膠原的mRNA表達(dá)的比較 乙醇組的羥脯氨酸含量，Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的mRNA表達(dá)水平以及Ⅰ型/Ⅲ型膠原比值高于對照組（P<0.01），見表2，圖1、2。

表2 2組大鼠左室心肌羥脯氨酸含量和膠原的mRNA表達(dá)比較±s）

表2 2組大鼠左室心肌羥脯氨酸含量和膠原的mRNA表達(dá)比較±s）

**P＜0．01

組別對照組乙醇組t n 12 12羥脯氨酸（mg/L）2.27±0.17 3.21±0.28 18.391**Ⅰ型膠原0.47±0.07 1.10±0.09 11.845**Ⅲ型膠原0.63±0.08 1.28±0.17 9.067**Ⅰ型/Ⅲ型膠原比值0.75±0.02 0.87±0.04 9.893**

圖1 RT-PCR檢測Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)

圖2 RT-PCR檢測Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)

2.3 相關(guān)性分析 心肌羥脯氨酸含量、心?、裥秃廷笮湍z原的mRNA表達(dá)水平及Ⅰ型/Ⅲ型膠原比值都與左室等容舒張時間（IVRT）呈正相關(guān)（P<0.05），與Ea/Aa比值呈負(fù)相關(guān)（P<0.01），見表3。

表3 左室心肌羥脯氨酸含量及Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)水平與左室舒張功能參數(shù)的相關(guān)性

3 討論

在美國，酒精中毒是當(dāng)今五大公眾健康問題之一，它經(jīng)常會引起心肌功能障礙。在中國，過量飲酒也是個普遍社會現(xiàn)象。長期酗酒可以導(dǎo)致酒精性心肌病（alcoholic cardiomyopathy，ACM），常表現(xiàn)為充血性心力衰竭[4]。

在本研究中，大鼠慢性飲酒，攝入的乙醇量是（5.00±0.82）g/（kg·d），該攝入量與人類酒精性心肌病患者的乙醇攝入量[大約3～4 g/（kg·d）]相當(dāng)[4]。飲酒時間16周，約為大鼠壽命的1/9，這與人類ACM患者飲酒史8年左右相接近。采用多普勒超聲心動圖-二尖瓣血流頻譜，理論上可以檢測大鼠E、A、E/A比值和IVRT。然而，由于大鼠心率過快（＞200次/min），因而E、A峰融合，難于分析E、A比值，因此本實驗在評價大鼠的舒張功能時，采用了TDI技術(shù)。反向的Ea、Aa峰分別代表心室舒張早期及心房收縮期左室心肌擴(kuò)張性運動，Ea/Aa比值被認(rèn)為是評價心室舒張功能的良好指標(biāo)，它不依賴于左室負(fù)荷的大小。本研究發(fā)現(xiàn)，提示乙醇喂養(yǎng)大鼠16周后可出現(xiàn)左室舒張功能異常。

臨床上早已發(fā)現(xiàn)酒精性心肌病會出現(xiàn)心肌纖維化，但其病理機(jī)制尚未完全明確[5]。最近有研究報道乙醇引發(fā)人心力衰竭的發(fā)病機(jī)制可能與心肌細(xì)胞骨架、細(xì)胞外基質(zhì)和（或）心肌結(jié)構(gòu)蛋白的改變有關(guān)[1]。本研究結(jié)果提示長期飲酒可以增加大鼠心肌膠原的合成。膠原過度沉積會造成心肌纖維化，這是導(dǎo)致長期過量飲酒者左室心肌重構(gòu)和心衰的重要原因[5]。Cheng等[6]也發(fā)現(xiàn)慢性飲酒會直接造成心肌收縮力減弱，并且會引發(fā)進(jìn)行性左室舒張功能損害和左室心肌重構(gòu)。

本研究分析發(fā)現(xiàn)心肌羥脯氨酸含量、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)和Ⅰ型/Ⅲ型膠原mRNA比值都與IVRT呈正相關(guān)，而與Ea/Aa比值呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果提示心肌膠原蛋白水平和mRNA水平含量的變化都與心臟舒張功能的改變明確相關(guān)。由于膠原僵硬度較高，纖維化會降低心室順應(yīng)性，其結(jié)果會造成心室早期充盈降低和心房代償性收縮[7]，在本研究中體現(xiàn)為Ea/Aa<1及IVRT延長。

總之，乙醇喂養(yǎng)大鼠16周后導(dǎo)致心臟損害，表現(xiàn)為心臟舒張功能減低和心肌膠原合成增加，這提示心肌膠原合成增加可能是大鼠心臟舒張功能減低的一個重要發(fā)病機(jī)制。本研究乙醇組大鼠未出現(xiàn)收縮性心衰，即尚未構(gòu)成晚期ACM模型，可能因飲酒時間尚短；本研究也僅揭示出飲酒導(dǎo)致心肌膠原紊亂的現(xiàn)象，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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