陳乃耀,王大力,張 江,汪 靜

研究已證實化療藥物可以使白血病細胞的惡性增殖受到抑制,加速細胞的凋亡,而且在分子水平上可以出現(xiàn)凋亡相關基因的改變[1-2]?，F(xiàn)以 K562細胞為研究對象,檢測格列衛(wèi)

(STI571)單藥及 STI571與三氧化二砷 (As2O3)聯(lián)合應用對白血病細胞某些生物學特性及與 BCR/ABL融合基因下游信號通路有關的凋亡相關因子 Caspase-3和 Bcl-xL mRNA表達的影響,以探明兩藥抗白血病細胞作用的可能的分子機制,為臨床治療白血病提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 K562細胞 (中國醫(yī)學科學院血液病研究所),RPMI1640培養(yǎng)基 (美國 GIBICO公司),Trizol(美國invitrogen公司),AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (上海生工生物技術有限公司),AnnexinV/PI檢測試劑盒 (晶美生物工程公司),STI571(諾華公司),As2O3(哈爾濱伊達藥業(yè)有限公司),焦碳酸二乙酯 (DEPC)原液 (中國醫(yī)學科學院血液研究所),超凈工作臺 (青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司),Line-gene熒光定量、PCR檢測系統(tǒng) (杭州博日科技有限公司)等。

1.2 方法步驟 (1)配制 RPMI1640培養(yǎng)基、100×雙抗、DEPC原液、四甲基噻唑藍 (MTT)溶液等。 (2)K562細胞的復蘇、凍存。(3)分組:對照組為未用藥物處理的 K562懸浮培養(yǎng)組;實驗 1組 (EG1組)為單用 1μmol/L STI571處理組,實驗 2組 (EG2組)為 1μmol/L STI571與 2μmol/L As2O3處理組。(4)實驗前 24 h,2×106/ml的 K562細胞換用無血清的 RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng),使細胞同步化。(5)實驗開始時結(jié)束同步化,用含 10%胎牛血清 (FBS)的 RPMI1640培養(yǎng)基,按照上述藥物濃度向細胞懸液中加入藥物,反復吹打混勻。在 37℃、5%二氧化碳 (CO2)、飽和濕度的條件下培養(yǎng) 24 h。室溫下 1 000 r/min離心 5 min,棄上清,收集 K562細胞,進行總 RNA的提取。用紫外分光光度計行 RNA純度測定,即測定 RNA光密度 (OD),滿足 OD260值 /OD280值為 1.6。(6)參照試劑盒說明書將總 RNA進行反轉(zhuǎn)錄,合成 cDNA。(7)PCR反應。引物設計:應用 Primer premier 5生物設計軟件分別設計出 Caspase-3、Bcl-xL及 β-actin的上游引物及下游引物。Caspase-3:上游 5′-TTTTTCAGA GGGGATCGT TG-3′, 下游 5′-CGG CCT CCA CTG GTA TTT TA-3′, 擴增產(chǎn)物為 151 bp。Bcl-xL:上游 5′-GTA AAC TGG GGT CGC ATT GT-3′, 下游 5′-TGC TGC ATT GTT CCC ATA GA-3′,擴增產(chǎn)物為 198 bp。β-actin:上游 5′-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3′,下游 5′-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3′,擴增產(chǎn)物為 205 bp。3組引物均由上海生工生物科技有限公司合成,按照說明,在 200μl無酶 EP管中加入 2×Sybr Mix、PCR Forward Primer等成分,構(gòu)成反應體系。

1.3 結(jié)果評定 目的基因的數(shù)量用相對定量的方法來表示,內(nèi)參基因 β-actin的數(shù)量需進行標準化。先分別獲得對照組和實驗組目的基因、內(nèi)參基因的 CT值。ΔCT(1)=(實驗組目的基因 CT值 -實驗組內(nèi)參基因 CT值);ΔCT(2)=(對照組目的基因 CT值 -對照組內(nèi)參基因 CT值);ΔΔCT=ΔCT(1)-ΔCT(2)。需要分析的實驗組目的基因相對于對照組目的基因的量用 2-ΔΔCT求得。實驗重復 3次,取平均值,繪制2-ΔΔCT值的直方圖 。

1.4 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)以 (x±s)表示,采用 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。兩組計量資料的比較用 t檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

與對照組 〔Bcl-xL mRNA的表達為 (0.75±0.08)〕相比,EG1組、EG2組 Bcl-xLmRNA的表達減少,且減少程度EG2組 ＞EG1組,差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。與對照組〔Caspase-3 mRNA表達為 (0.96±0.05)〕相比,EG1組、EG2組 Caspase-3 mRNA的表達增加,且增加程度 EG2組 ＞EG1組,差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05,見表 1)。

表 1 實驗組 K562細胞 Bcl-xL mRNA和 Caspase-3 mRNA的表達(x±s)Table 1 The 2-ΔΔCT value of Bcl-XL and Caspase-3 mRNA of K562 cells in EG1 and EG2 groups

3 討論

在我國慢性粒細胞白血病 (CML)占白血病的 20%,病死率極高,且缺乏有效的治療手段[3-4]。隨著對 CML發(fā)病機制研究的不斷深入,CML的治療也已經(jīng)到了針對 BCR/ABL基因的分子水平。研究發(fā)現(xiàn),在慢性期的治療中 STI571有顯著的療效,大多數(shù)患者的急性變將被延遲若干年,但對于急變期患者來說 STI571的療效降低,這可能與耐藥的產(chǎn)生有關[5]。正是由于 STI571在治療中存在的不足,引起了人們對其他靶點藥物的關注,As2O3便是治療 CML的新型靶點藥物之一,于是 STI571與 As2O3聯(lián)合應用的方法開始被學者關注,兩藥共同作用可能涉及的分子機制目前尚未闡明。

為了進一步證實這兩種藥物在分子水平上的作用,采用目前較新的實時熒光定量 PCR方法來檢測凋亡相關基因的表達情況。本研究以凋亡相關基因 Caspases家族和 Bcl-2家族中的重要成員 Caspase-3、Bcl-xL為研究對象,是因為它們與CML的發(fā)病相關,受 BCR/ABL下游多種信號轉(zhuǎn)導途徑的影響[6-7],且它們之間可以相互制約,都是在線粒體水平上發(fā)揮作用,與 STI571及 As2O3的作用機制相關聯(lián)。通過實時熒光定量 PCR方法檢測對照組及 EG1組、EG2組 K562細胞Caspase-3、Bcl-xL mRNA的表達,發(fā)現(xiàn)單用 STI571與STI571聯(lián)合 As2O3應用相比較,后者使 Bcl-xL mRNA表達下降更明顯,而 Caspase-3 mRNA表達增加更明顯,且這種差異有統(tǒng)計學意義。提示 As2O3增強 STI571抗白血病細胞作用的分子機制可能是通過使抗凋亡基因 Bcl-xL表達減少和促凋亡基因 Caspase-3表達增多而實現(xiàn)的。而且在實驗條件下,較低濃度的 As2O3與 STI571在較短時間就可出現(xiàn)這種抗白血病細胞的作用。由此我們推測 As2O3可能是通過其線粒體途徑直接激活 Caspase-3,并且通過阻斷 BCR/ABL的惡性信號轉(zhuǎn)導,下調(diào) Bcl-xL間接地活化 Caspase-3,這樣也就使得STI571下調(diào) Bcl-xL,最終激活 Caspase-3而誘導細胞凋亡的作用加強;正是由于藥物在根本上使得這兩種基因的表達發(fā)生了變化,所以得到了宏觀上光密度值及凋亡率的相應變化。

總之,本研究選擇 STI571及 As2O3作為干預措施來研究K562細胞的變化,發(fā)現(xiàn)了藥物對細胞的增殖及凋亡的作用,并且從基因水平得到了證實,這對于 CML的臨床治療特別是終末期的治療具有重要的指導意義;與 As2O3聯(lián)用,可以作為STI571克服自身不足及提高其療效的一種方法,為臨床治療CML提供了新的思路。

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4 Thievle J,Kvasnicka HM,Schmitt-Graeff A,et al.Bone marrow histopathology predicting blast crisis in chronic myeloid leukemia[J].Acta Haematol,2001,105(4):244-246.

5 Fang G,Kim CN,Perkins CL,et al.CGP57148B(STI571)induces differentiation and apoptosis and sensitizes Bcr-Abl-positive human leukemia cells to apoptosis due to antileukemic drugs[J].Blood,2000,96(6):2246-2253.

6 Johansson B,Fioretos T,Mitelman F.Cytogenetic and molecular genetic evolution of chronic myeloid leukemia[J].Acta Haematol,2002,107(2):76-94.

7 Soto-Cerrato V,Llagostera E,Montaner B,et al.Mitochondriamediated apoptosis operating irrespective of multidrug resistance in breast cancer cells by the anticancer agent prodigiosin[J].Biochemical Pharmacol,2004,68(7):1345-1352.