胡清靜，張成君，郭景，褚兆晶，安娟

蘭州大學資源環(huán)境學院，甘肅 蘭州 730000

影響植物同位素組成（δ13C）的因素較多。例如，許多生物因素(植物間的競爭、植物的不同發(fā)育期、植物的不同部位、化學組成、葉齡、葉片的結構等)和非生物因素(水分、溫度、濕度、光、CO2濃度、海拔高度、土壤鹽分、土壤養(yǎng)分、大氣污染物等)。研究表明，水分條件對植物同位素組成的影響較大，并對此做了大量的研究工作。同時，大氣中CO2濃度的變化也是改變植物同位素組成的主要因素之一。Farquhar等[1]研究表明，植物的δ13C值可由下式來表示：

式(1)和式(2)中，δ13Cp和δ13Ca分別為植物組織及大氣CO2的碳同位素比率，a和b分別為CO2擴散和羧化過程中的同位素分餾，而Ci和Ca分別為細胞間及大氣的CO2濃度。

在植物生長過程中，植物葉片的氣孔參數(shù)隨環(huán)境參數(shù)影響的變化較大，葉片氣孔的變化可能影響到a、Ci等的變化，進而影響到植物同位素組成的變化，而目前對這方面的研究還不是很成熟[2-4]。城市環(huán)境中影響植物生長的環(huán)境因素相對自然環(huán)境復雜，因此，本文主要針對干旱-半干旱區(qū)城市中植物葉片碳同位素組成隨生長季節(jié)的變化，了解葉片氣孔的發(fā)育過程，并了解降水、光照、大氣污染物濃度等環(huán)境指標的變化對植物葉片碳同位素組成的影響，從而進一步認識影響植物葉片碳同位素組成的主要環(huán)境因素和特征。

1 樣品的采集和分析

植物銀杏(Ginkgo biloba)葉片樣品采自蘭州大學校園內。蘭州地處內陸，屬中溫帶大陸性氣候，冬無嚴寒、夏無酷暑，氣候干燥，氣溫日差較大，光照充足，太陽輻射強。年平均氣溫在0～14 ℃之間，年均降水量300 mm左右，降水各季分配不勻，主要集中在6～9月，無霜期180 d以上。蘭州市區(qū)植物大約四月初開始發(fā)芽長葉。從2009年4月15日至2009年10月15日，每15天采集一次，分東西南北四個方向采集不同銀杏葉片。各個方向離地面高大約2米左右，采集5～6片。主要采集成熟葉片，并截取每片葉片的中心部位進行前處理。陳立群[5]分析表明在同一片葉子上，中間部位是氣孔密度和氣孔指數(shù)最穩(wěn)定的區(qū)域。采集后的銀杏葉片在實驗室內用蒸餾水洗凈后，部分葉片在45 ℃恒溫下干燥48 h以上，烘干用做碳同位素組成分析。另外2～3片銀杏葉用雙氧水和冰醋酸銨溶液（體積比1∶1）浸泡后，在70 ℃下煮3～4 h，直至葉片褪成白色為止。在加熱過程中上下表皮間有氣泡逸出，可以將上下表皮分開。然后將葉片中心部位的上下表皮平鋪在同一載玻片上，并用番紅染色。再在載玻片上滴加甘油，盡量消除氣泡。多余的甘油用濾紙吸取，干后用指甲油封上蓋玻片進行氣孔參數(shù)測定。

采集的銀杏葉片主要進行同位素組成和氣孔參數(shù)測定。同位素分析將烘干后的銀杏葉片研磨成60～100目的粉末，將大約0.1～1 μg粉末樣裝入石英舟中，在氧氣流下，850 ℃加熱約15 min，產(chǎn)生的CO2氣體通過液氮、酒精-液氮冷阱收集、純化后引入到 MAT-252穩(wěn)定同位素質譜儀中分析碳同位素組成。結果以PDB-δ表示，樣品分析精度≤0.2‰。樣品在中國科學院蘭州地質研究所測定。

將封上蓋玻片的上下表皮層載玻片在蘭州大學實驗中心的高倍銀光顯微鏡下觀察并拍照。其中測定氣孔密度樣品在10×10倍鏡下拍照（每個樣品拍5～6張）并統(tǒng)計，測定氣孔長、寬的樣品在10×40倍鏡下拍照（每個樣品拍 8～10張）并統(tǒng)計。照片在image 5.0軟件中觀測氣孔密度和氣孔的大小。

2 結果與分析

銀杏葉片碳同位素組成分析主要包括從4月15日開始大約每隔 15天采集一次東、南、西、北四個方位葉片的碳同位素組成，以及這四個方向葉片混合后的碳同位素組成。不同方向葉片的碳同位素組成分析結果見圖 1?；旌先~片碳同位素組成分析結果見圖 2。從四月初生長開始，到大約十月中旬天氣變冷，植物停止生長為止，不同方向的銀杏葉片碳同位素組成總體上逐漸偏輕變負，但是不同方向葉片的變化沒有太明顯的規(guī)律性。從五月份以來，上旬不同方向葉片同位素組成相對偏重，下旬偏輕。在九月上旬不同方向葉片同位素組成最輕。不同方向的混合葉片碳同位素組成總體趨勢與不同方向葉片碳同位素組成總趨勢一致。

針對蘭州市區(qū)銀杏葉片在整個生長季中氣孔的演化特征，生長季中降水、溫度、光照和城市中比較特征的大氣污染物濃度的變化（轉換為污染指數(shù)的變化）對葉片碳同位素組成的影響進行分析（圖2），圖2中標出了不同參數(shù)與葉片碳同位素組成之間的相關系數(shù)值（r）。將氣孔比表面積（單個葉片中氣孔的總面積與葉片面積之比）、氣孔面積（單個葉片中氣孔的總面積）、氣孔密度（單個葉片中氣孔的總個數(shù)）作為氣孔的主要參數(shù)，以了解氣孔參數(shù)特征對葉片同位素組成的影響。

2.1 光照對銀杏葉片同位素組成的影響

研究表明，植物組織、甚至組成植物葉片類脂化合物的碳同位素組成受光照的影響比較明顯[6]。一般來說，陽面葉的同位素組成偏重，陰面葉的同位素組成偏輕[7]。Lockheart等[7]和 Farquhar等[8]研究認為光強度的下降會導致植物葉片有較高的胞間和大氣CO2濃度比值(Ci/Ca)。根據(jù)式(1)，當植物碳同位素組成在氣孔關閉時，Ci值減小；相反，氣孔張開時，Ci值增加。光照對氣孔的開閉有直接的影響，光照加強時，氣孔關閉，可能的原因是防止水分的過度蒸騰[9]。植物冠層中陽面葉比陰面葉具有較高的δ13C值, 也是由于陽面葉蒸發(fā)加強導致水分消耗增多, 因此氣孔關閉程度較陰面葉高，以利于植物的生長[10]。Kürschner 等[11]和 Poole 等[12]的研究也表明陽面葉和陰面葉的氣孔特征有極大的差異性，表明光照對植物葉片氣孔影響較為直接，而葉片通過氣孔的開閉適應生長的需要，進而影響了葉片碳同位素組成特征。

圖1 不同方位銀杏葉片碳同位素組成Fig.1 The carbon isotopic compositions of Ginkgo leaves at difference directions

圖2 銀杏葉片碳同位素組成與氣孔參數(shù)、環(huán)境因素之間的相關性分析Fig.2 The comparing among the carbon isotope of Ginkgo leaves and parameters of leaves and environmental parameters

然而，本文對蘭州市校園中銀杏葉片生長期中的同位素分析結果發(fā)現(xiàn)（圖1），同位素組成與光照（方向性）表現(xiàn)不是很明顯。一般來說，南方和西方的光照時間及強度相對較大，但總體上沒有十分明顯的規(guī)律性。Lockheart 等人對相同樣品的分析結果顯示出，沒有1995年采集的樣品差異性強[6-7]，陽面葉和陰面葉之間的同位素組成變化不如以前的明顯。這其中的規(guī)律性我們目前還不十分清楚，但城市中植物生長環(huán)境與較空曠的自然環(huán)境存在一定的差異性。例如，周圍高大建筑影響太陽對植物葉片的照射、城市中的大氣環(huán)境條件等的影響，還需要進一步觀察分析。

Farquhar等[1,8]和 Vogel[13]的研究表明，影響植物葉片碳同位素組成的因素主要有3個，包括大氣CO2的δ13C、大氣CO2的濃度(Ca)、以及CO2在葉片胞間濃度(Ci)與大氣中CO2的濃度的比值(Ci/Ca)，也可以表示為壓力比值（pi/pa)。在一定地區(qū)，δ13C和Ca基本保持不變，因此，影響葉片碳同位素組成主要是Ci/Ca，或者pi/pa。而這個比值隨氣孔參數(shù)變化，即是說光照的變化對葉片氣孔參數(shù)影響較大。但是，我們的分析結果中（圖3）氣孔密度、氣孔比表面積、氣孔平均面積等參數(shù)也沒有明顯的規(guī)律性。說明影響氣孔的因素不僅是光照，可能還有其它的一些因素。

圖3 銀杏生長期中葉片氣孔參數(shù)的變化特征Fig.3 The characteristic of the stomatal parameters in the growing period of Ginkgo

2.2 降水和溫度對植物葉片碳同位素組成的影響

圖2分析表明，銀杏葉片碳同位素組成與降水量（r=0.586）、蒸發(fā)量（r=0.492）、溫度（r=0.207）和有效濕度（r=0.761）之間均有一定的相關性。特別是與有效濕度之間的相關性最好（r=0.761，P<0.01），說明有效濕度是控制植物碳同位素組成的一個主要環(huán)境因素。

目前的研究發(fā)現(xiàn)，植物碳同位素組成與降水量的關系十分密切，尤其是在干旱-半干旱地區(qū)[14,15,16]。例如，ZHANG等對中國西北地區(qū)和青藏高原現(xiàn)代植物的調查表明，C3植物的碳同位素組成與降雨有明顯的關系，干旱環(huán)境C3植物的碳同位素值較重[15]。同時，王國安[16]分析發(fā)現(xiàn)了北方C3草本植物碳同位素組成與濕度有關，而某些種類的C3植物碳同位素組成也與溫度相關[14]。Krner等[17]發(fā)現(xiàn)植物的δ13C值隨溫度升高而降低，而Stuiver和Braziunas[18]的結果則顯示溫度與δ13C呈正相關。Lee等[19]和Feng等[20]通過對中國寶雞至外蒙古北界斷面的植物、土壤有機碳同位素組成分析，得出植物同位素組成與有效濕度之間有較好的相關性。盡管從現(xiàn)代植物樣品的分析結果，植物碳同位素組成與降水量之間的相關性較為明顯，而與溫度變化不十分明顯，但可以肯定的是在干旱-半干旱區(qū)降水和溫度對植物碳同位素組成有一定的影響。而在降水量較大的地區(qū)，這種關系可能不十分明顯。Schulze等[21]測定了不同生活型喬木的Δ值，在降雨量高于475 mm的地區(qū)，群落的平均Δ值基本相同；而在降雨量低于475 mm的地區(qū)，則從19‰下降至17‰ (220 mm)。說明在降雨量高的地區(qū)植物碳同位素組成變化不十分顯著。

對干旱區(qū)植物碳同位素組成的分析表明，隨著降水量（特別是有效濕度）的增加，碳同位素組成偏輕；相反，碳同位素組成偏重。這與植物對水分的利用狀況一致。水分較多的情況下，葉片氣孔開度較大，Ci值大，導致植物碳同位素組成偏輕。對于不同種屬植物，盡管有相同的規(guī)律，但是因植物生理等因素的差異，碳同位素組成相差較大。同種植物之間碳同位素比率由于環(huán)境的差異(如水分、空氣濕度、污染物等)，其δ13C值可達3‰～5‰[22,23]。

雖然，葉片碳穩(wěn)定同位素組成(δ13C)反映了環(huán)境變化對Ci/Ca的影響。但是當水分對植物生長并不是一個主要限制因子時，δ13C值受到蒸氣壓虧損(vapor pressure deficit, VPD)、光照、葉片含量等多個因子的影響[24]。因此，從我們對蘭州市銀杏葉片同位素組成的分析結果（圖2）也可以看出，同位素組成與多個環(huán)境因素之間有不同程度的相關性。

2.3 大氣污染物對植物葉片碳同位素組成的影響

從圖2中，我們發(fā)現(xiàn)銀杏葉片碳同位素組成與植物生長期蘭州市大氣污染指數(shù)（大氣中氮氧化物、硫氧化物、大氣顆粒物）之間的相關性較高（r=0.550），反映了大氣污染物對植物碳同位素組成的影響。

O’leary[22]分析得出由于污染物、光照、蒸氣壓虧損等可造成植物碳同位素組成之間的差異。對蘭州市葉片δ13C值與大氣二氧化硫濃度的分析，得出δ13C值與大氣二氧化硫濃度呈顯著性正相關(r=0.828,P<0.01)[25]。Martin等[26]研究在不同SO2、O3、NOx濃度下生長的植物葉片δ13C值的變化情況，發(fā)現(xiàn)生長在污染物高濃度下葉片δ13C值要高于偏正清潔環(huán)境下的葉片δ13C值。說明隨大氣污染物濃度上升，植物碳同位素組成偏重。大氣中的二氧化硫、臭氧、氮氧化物會降低葉片的氣孔導度和光合速率。當大氣中污染物濃度升高時，植物的穩(wěn)定碳同位素分餾降低，Pi值減小進而使得Pi/Pa值減小，植物的δ13C值偏正。因此，在周圍大氣污染物濃度高的情況下，植物為了防止有害氣體對自身的傷害而關閉部分氣孔致使細胞內二氧化碳濃度降低，Pi減小，δ13C值偏正。

2.4 環(huán)境因素對植物葉片碳同位素組成的影響

由于植物碳同位素組成受到較多環(huán)境因素的影響，尤其是在城市中的植物不僅受到自然光照、降水量、蒸發(fā)量、溫度等環(huán)境參數(shù)的控制，而且，由于城市中人類活動產(chǎn)生了大量的大氣污染物，以及城市特殊的環(huán)境導致不同方向光照強度與自然環(huán)境中的差異，眾多的原因使植物碳同位素組成的影響因素變得相對復雜。當對某一城市環(huán)境中植物碳同位素組成影響因素的了解，對城市生態(tài)系統(tǒng)的認識卻有相當重要的價值。因此，我們通過對蘭州市區(qū)校園中銀杏葉片生長期中碳同位素組成與生長季中降水、溫度、光照、大氣污染物濃度的變化（轉換為污染指數(shù)的變化）、氣孔比表面積、氣孔面積、氣孔密度等環(huán)境因素的綜合相關性分析，了解各環(huán)境因素對植物碳同位素組成的影響。

圖4 蘭州市銀杏葉片生長期碳同位素組成與環(huán)境因素之間的相關性分析Fig.4 The relationships among environmental parameters and carbon isotope of Gingko leaves in the period of growing at Lanzhou

對于多指標的相關性分析，CANOCO分析軟件是目前生物學中運用較廣的一個數(shù)理統(tǒng)計軟件。分析結果見圖4。從圖中可以明顯反映出不同環(huán)境參數(shù)之間的相互關系，其中污染指數(shù)與葉片的氣孔參數(shù)的相關性很好，說明了大氣污染對植物葉片氣孔的影響較為明顯，這也反映了葉片碳同位素組成受大氣污染物的影響。葉片同位素組成與降水量和有效濕度有較好的相關關系，而與溫度的相關性相對較差。葉片氣孔參數(shù)對葉片碳同位素組成有一定的影響，但是反映不出如Farquhar等[1]提出的植物葉片同位素組成受 Ci/Ca，或者 Pi/Pa的制約，而是受到不同的環(huán)境參數(shù)共同影響，并且這些環(huán)境參數(shù)之間也是相互影響，造成植物碳同位素組成隨環(huán)境的差異有很大的不確定性。事實上，Leuning[27]通過長期的實驗觀察和分析發(fā)現(xiàn)，非常多的植物種屬在不同的環(huán)境中Ci/Ca比值基本處于恒定狀態(tài)。因此，植物同位素組成的變化則明顯受其它因素的影響。

3 結論

影響植物碳同位素組成的環(huán)境因素較多，在環(huán)境參數(shù)越復雜的地區(qū)控制因素則越多。城市環(huán)境相對于自然環(huán)境來說，不僅氣象因素對植物同位素組成有較大的影響，而且，城市環(huán)境中人為因素如大氣污染物、城市建筑對植物受光的改變等均可以影響植物的碳同位素組成。蘭州市校園中銀杏各向葉片生長期的同位素組成受到降水、溫度、光照、大氣污染物濃度的變化（轉換為污染指數(shù)的變化）、氣孔比表面積、氣孔面積、氣孔密度等環(huán)境因素的綜合影響，通過CANOCO統(tǒng)計分析表明，城市中大氣污染物濃度的變化對植物同位素組成的影響較大。

致謝：本文受國家自然科學基金（40773064）資助。在實驗樣品采集和制備過程中，李建偉、張明鎮(zhèn)和高賢良同學給予我極大的幫助，在此致以誠摯的謝意！

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