陳立，萬力，張發(fā)旺，何澤

1.中國地質(zhì)大學(xué)（北京）水資源與環(huán)境學(xué)院，北京100083；2.中國地質(zhì)科學(xué)院水文地質(zhì)環(huán)境地質(zhì)研究所，河北 石家莊 050061

我國西北黃土高原地區(qū)由于石油資源的大量開采利用，產(chǎn)生了許多環(huán)境問題，尤其是落地原油的污染已影響土壤的質(zhì)量安全。土壤石油污染的防治研究工作已受到人們的重視，利用微生物修復(fù)石油污染土壤技術(shù)的開發(fā)與研究也受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[1-6]。微生物修復(fù)技術(shù)主要機(jī)理是石油烴直接參與了微生物的生化反應(yīng)，微生物利用石油烴作為生長所需的碳源和能源，并在酶的催化下將其水解成甘油、脂肪酸，最后降解為 H2O、CO2等代謝產(chǎn)物[7]。Jorgensen[8]的試驗(yàn)顯示，經(jīng)生物堆埋，被石油污染的土壤中石油可降低 71%。目前已知能降解石油中各種烴類的微生物共有約100余屬200多種，它們分屬于細(xì)菌、放線菌、霉菌、酵母以及藻類[9]。以往的報(bào)道多為室內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)場原位修復(fù)鮮有報(bào)道。本文選擇陜北某油井旁污染土壤，利用放大培養(yǎng)的土著微生物菌劑，輔以物理和化學(xué)的方法，通過野外原位試驗(yàn)的方法，開展微生物修復(fù)石油污染土壤技術(shù)的試驗(yàn)研究，探索微生物修復(fù)技術(shù)在黃土區(qū)石油污染土壤修復(fù)的有效性、科學(xué)性、生態(tài)性，以期為當(dāng)?shù)氐乃帘３趾蜕鷳B(tài)環(huán)境保護(hù)提供技術(shù)支撐。

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 場地背景

場地位于陜西安塞西北約20 km某采油場內(nèi)，黃土土壤，試驗(yàn)深度0～15 cm，土中含有少量2～10 mm的小礫石，土壤濕容重為1.821 g·cm-3；自然含水量為 9.18%；pH 為 8.4；NO3-質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 55.3 mg·kg-1；NH4+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 8.85 mg·kg-1；石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1.3～4.6 mg·kg-1。

1.2 材料

1.2.1 化學(xué)試劑 MgSO4·7H2O、NH4NO3、CaCl2、FeCl3、KH2PO4、K2HPO4、KCl、鹽酸、石油醚、三氯甲烷等，均為分析純，主要由北京北化精細(xì)化學(xué)品公司和天津市四通化工廠生產(chǎn)，生化試劑主要從北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司購置。

1.2.2 填加劑 谷糠黍糠、麥麩等

1.2.3 試驗(yàn)用水 為當(dāng)?shù)販\層潛水，pH為8.2，可溶性固體總量(TDS)為 420.5 mg·L-1；

1.2.4 試驗(yàn)所用的石油 為當(dāng)?shù)卦?，油層深度?400 m。

1.2.5 主要儀器 QZD-1型電磁振蕩器、KQ218超聲波清洗器、生物恒溫箱、高速離心機(jī)、高壓蒸汽滅菌器、無菌實(shí)驗(yàn)室、生化培養(yǎng)箱、752N紫外可見光光柵分光光度計(jì)、pHB-3型pH計(jì)、DDB-303A型電導(dǎo)率儀、電熱干燥箱等。

1.3 方法

1.3.1 測試方法 石油、NO3-采用紫外分光光度法、NH4+采用納氏試劑比色法、pH用pH計(jì)測試，TDS用電導(dǎo)率儀測試換算得出。

1.3.2 降解石油微生物細(xì)菌培養(yǎng)優(yōu)選方法 土壤微生物細(xì)菌培養(yǎng)用《土壤微生物研究法》[10]和參考文獻(xiàn)[11-13]介紹的方法，細(xì)菌初步鑒定用《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]中的方法。

2 試驗(yàn)過程

2.1 菌種的分離與優(yōu)選

用細(xì)菌的選擇性培養(yǎng)基和富集培養(yǎng)基，對試驗(yàn)場石油污染土壤的樣品進(jìn)行菌種、菌群的培養(yǎng)分離，選擇優(yōu)化出試驗(yàn)用降解土壤石油的土著菌種、菌群。選擇優(yōu)化出的土著細(xì)菌經(jīng)初步鑒定，主要為：假單胞菌屬（Pseudomonas）、微球菌屬（Micrococcus）、放線菌屬（Actinomayces）、真菌類的青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）等菌群。

2.2 試驗(yàn)小區(qū)的設(shè)置和步驟

2.2.1 試驗(yàn)小區(qū)設(shè)置為 試驗(yàn)區(qū) 1、試驗(yàn)區(qū) 2、對照區(qū)、空白區(qū)。小區(qū)規(guī)格為：120 cm×120 cm，各小區(qū)相間20 cm，小區(qū)由西向東一字排列。

2.2.2 試驗(yàn)步驟

用當(dāng)?shù)厝〉玫脑妥魈荚?污染物)，根據(jù)試驗(yàn)用接種量將選擇優(yōu)化出的各土著菌種、菌群進(jìn)行放大培養(yǎng)，配成菌液制劑。將試驗(yàn)區(qū)、對照區(qū)和空白區(qū)的土壤進(jìn)行人工反復(fù)翻耕，翻耕深度控制在 15 cm左右，其中的土塊盡可能的打碎。在試驗(yàn)區(qū)1、試驗(yàn)區(qū)2和對照區(qū)土壤翻耕深度內(nèi)均勻混入一定量的石油。在試驗(yàn)區(qū)1中按試驗(yàn)土壤質(zhì)量的2.5%混入谷糠黍糠，在試驗(yàn)區(qū)2中按試驗(yàn)土壤質(zhì)量的2.5%混入麥麩，作為添加劑；將一定量（占試驗(yàn)土壤質(zhì)量的 3%）的土著菌液制劑用噴霧器均勻地接入試驗(yàn)區(qū)1和試驗(yàn)區(qū)2的土壤中，根據(jù)培養(yǎng)基成分比例加入氮、磷、鈣、鎂、硫、鐵等調(diào)控營養(yǎng)元素，用當(dāng)?shù)氐叵滤{(diào)節(jié)土壤水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)至20%左右。對照區(qū)只加入一定量的石油，未加其它成分，作為自然降解。最后進(jìn)行反復(fù)翻耕以便各種試驗(yàn)材料混合均勻，在試驗(yàn)區(qū)覆蓋塑料薄膜便于保溫、保濕、防雨?？瞻讌^(qū)不加任何物質(zhì)作為監(jiān)控樣品。每次取樣后，翻耕土壤層使其暴氣充氧并補(bǔ)水，保持土壤水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)在20%左右。

2.3 取樣及測試

按一定時間間隔分別在各個區(qū)取樣測試，每個區(qū)中以梅花狀取5個不同點(diǎn)的同一深度土樣，然后在盤子里混合均勻用4分法取樣測試。試驗(yàn)完成后分別對各區(qū)試驗(yàn)層以下一定深度內(nèi)分層取樣。測試項(xiàng)目包括：石油烴總量、pH、土壤易溶鹽、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、NH4+質(zhì)量分?jǐn)?shù)、NO3-質(zhì)量分?jǐn)?shù)等，并同時監(jiān)測地表及試驗(yàn)土壤溫度。

3 結(jié)果與討論

3.1 土壤中石油的去除率

在試驗(yàn)的0、3、7、11、16、21、26 d和32 d分別在試驗(yàn)區(qū)、對照區(qū)和空白區(qū)中取樣測試，結(jié)果見表1和圖1

從表1、圖1中可見，試驗(yàn)區(qū)和對照區(qū)中0～7 d內(nèi)，石油含量變化均很小，降解率均小于 8%且變化不大，說明試驗(yàn)區(qū)撒入的優(yōu)勢土著菌劑并沒有發(fā)揮作用；同時，該現(xiàn)象也說明土著微生物本身對土壤中的石油污染物具有降解作用；兩個試驗(yàn)區(qū)的降解率比對照區(qū)的降解率略高，這是因?yàn)樵囼?yàn)區(qū)中加入的氮、磷、鈣、鎂、硫、鐵等調(diào)控營養(yǎng)元素對土著微生物有激化的作用。

表1 各區(qū)土壤中石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨時間變化Table 1 Results of oil contents with time in the soil of experimental plots mg·kg-1

圖1 試驗(yàn)過程中各區(qū)土壤中石油累計(jì)降解率隨時間變化Fig.1 Cumulative degradation rate of oil with time in experimental plots through experimental process

7天以后兩個試驗(yàn)區(qū)中的石油含量明顯減少，對照區(qū)的含量變化不明顯，這是因?yàn)樵囼?yàn)區(qū)中加入的優(yōu)勢土著菌劑發(fā)揮作用，但該菌劑有延滯期（lag phase）。對比試驗(yàn)3 d和7 d的數(shù)據(jù)，可得菌劑的延滯期在3～7 d，然后進(jìn)入對數(shù)期（logarithmic phase）。在試驗(yàn)的第11 d即對數(shù)期后d天，兩個試驗(yàn)區(qū)的累計(jì)去除率就達(dá)到 69.52%以上，最大累計(jì)去除率達(dá)88.11%。對比兩個試驗(yàn)區(qū)的數(shù)據(jù)和曲線趨勢，說明所加入的谷糠黍糠、麥麩兩種添加劑所起作用相差不大。

從對照區(qū)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)看出，土著微生物本身對土壤中的石油污染物具有降解作用，本次試驗(yàn)累計(jì)去除率為20%左右，說明在自然條件下短時間內(nèi)土壤中石油降解是比較低效且緩慢的。試驗(yàn)區(qū)1的16、21 d測試數(shù)據(jù)和對照區(qū)的16 d測試數(shù)據(jù)與大趨勢略有差異，這可能是取樣不均所致，也可能是黃土土壤各向異性的性質(zhì)決定的。

空白區(qū)反映了在沒有加任何物質(zhì)情況下土壤中的石油含量，但在試驗(yàn)后期因試驗(yàn)區(qū)和對照區(qū)與空白區(qū)相鄰且加之降雨和人為取樣活動污染了該區(qū)，造成含量有所增加。

3.2 試驗(yàn)過程對下層土壤的影響

試驗(yàn)完成后，對兩個試驗(yàn)區(qū)、對照區(qū)和空白區(qū)中不同土壤深度的pH，石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、易溶鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)、NH4+質(zhì)量分?jǐn)?shù)和NO3-的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行了測試，結(jié)果見表2。從pH、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、易溶鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)、NH4質(zhì)量分?jǐn)?shù)和NO3-的質(zhì)量分?jǐn)?shù)來看，可得試驗(yàn)區(qū)有別于對照區(qū)和空白區(qū)，說明氮、磷等易溶鹽營養(yǎng)物質(zhì)有一小部分隨水而進(jìn)入下部土層。從測試結(jié)果可見，試驗(yàn)層以下土壤石油含量增加很少，與對照區(qū)和空白區(qū)相比只是淺層略高，說明試驗(yàn)層土壤中石油沒有向下擴(kuò)散，或少量進(jìn)入的營養(yǎng)物質(zhì)激化了下部土層中的微生物降解了下滲的石油。

3.3 修復(fù)過程中對影響因素的調(diào)控

修復(fù)效果關(guān)鍵是優(yōu)化的微生物和微地質(zhì)環(huán)境（土壤環(huán)境因子）的相互結(jié)合、相互依存、相互作用和調(diào)控。調(diào)控因素主要有溫度、水、氧氣、營養(yǎng)元素、土壤環(huán)境因子的改善等等。試驗(yàn)過程中對以上因素進(jìn)行了調(diào)控并跟蹤測試，結(jié)果見表3、表4、表5。

3.3.1 土壤溫度的調(diào)控

溫度是影響微生物生長與存活的重要因素之一，過高或過低的溫度都可抑制微生物生長。適度的溫度可使細(xì)菌細(xì)胞中的生物化學(xué)反應(yīng)速率加快。試驗(yàn)區(qū)強(qiáng)化的微生物菌群大多為中溫微生物(13～45℃)，25～38 ℃為最適生長溫度。

監(jiān)測試驗(yàn)階段地表的最高和最低溫度結(jié)果顯示，地表最高溫度在25 ℃以上（在8月下旬至9月上旬），最低溫度在20 ℃，晝夜溫差大。如何調(diào)控溫度，是試驗(yàn)效果好壞的關(guān)鍵。在兩個試驗(yàn)區(qū)用塑料薄膜進(jìn)行保溫，使試驗(yàn)區(qū)土壤溫度保持在25 ℃以上，但進(jìn)入9月后因氣溫明顯下降夜晚再用草簾覆蓋。從表3可看到試驗(yàn)區(qū)土壤在試驗(yàn)層15 cm深，溫度明顯增加，比空白區(qū)增高5 ℃-8 ℃以上，尤其是在9月上旬以前增溫保溫效果顯著。因此得出在該地區(qū)如若利用微生物生態(tài)修復(fù)技術(shù)的最佳時期應(yīng)在每年的6月下旬至9月上旬，通過調(diào)控可使土壤溫度保持在25 ℃以上。

表2 試驗(yàn)區(qū)2、對照區(qū)和空白區(qū)不同土壤剖面石油、pH、水分、易溶鹽、NH4+、NO3-測試結(jié)果Table 2 The test results of oil content, pH, water content, TDS, NH4+ and NO3- with time in the soil of experimental plot 2, control plot and blank plot

表3 9月2日—20日試驗(yàn)區(qū)1與空白區(qū)土壤(5～15 cm) 8時與18時的溫度Table 3 Temperature of soil (5～15cm) in experimental plot 1 and blank plot at 8:00 and 18:00 ℃

表4 試驗(yàn)區(qū)1、對照區(qū)和空白區(qū)土壤pH、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨時間變化測試結(jié)果Table 4 The test results of soil pH and water content with time in the soil of experimental plot 1, control plot and blank plot

表5 試驗(yàn)區(qū)2、對照區(qū)和空白區(qū)土壤易溶鹽、NH+、NO-43質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨時間變化測試結(jié)果Table 5 The test results of soil TDS, NH4+ and NO3-with time in the soil of experimental plot 2, control plot and blank plot

3.3.2 土壤pH、濕度分析

每一種微生物的生存都有一定的pH值范圍和最適pH值。大多數(shù)細(xì)菌的最適pH值為6.5～7.5，放線菌pH值為7.5～8.0，真菌則可以在廣泛的pH范圍內(nèi)生長發(fā)育。由表 4知試驗(yàn)區(qū) pH值保持在7.6～8.4，這是定期補(bǔ)充一定量的磷酸鹽緩沖劑的結(jié)果。表中所示pH多在8左右，這與大部分石油降解菌最適環(huán)境為偏堿性的性質(zhì)相符。而空白區(qū)、對照區(qū) pH值在 8.1～8.9比試驗(yàn)區(qū)略高一些。但在此pH值范圍內(nèi)對此次試驗(yàn)影響不大，試驗(yàn)區(qū)加入的磷酸鹽主要是為微生物的生長增加營養(yǎng)元素。

水是微生物對石油污染物降解過程中的重要介質(zhì)和氧的來源。前人研究表明，土壤濕度保持在20%以上對試驗(yàn)效果有利。因此，每次取樣后在試驗(yàn)區(qū)加入15 L（約占試驗(yàn)土層的4%）的水。在表4數(shù)據(jù)顯示試驗(yàn)層土壤水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)保持穩(wěn)定，這一含量基本保證了試驗(yàn)效果。空白區(qū)為天然變化的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，對照區(qū)因取樣后人為的翻耕可起到一定的保水作用，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)略高于空白區(qū)，并沒有對土壤石油降解起到足夠的作用，當(dāng)然這僅是

3.3.3 易溶鹽、NH4+、NO3-質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析

營養(yǎng)元素可參與微生物細(xì)胞組成、構(gòu)成酶的活性成分和物質(zhì)運(yùn)輸系統(tǒng)以及提供生理活動所需能量。在試驗(yàn)期，微生物必定消耗大量的營養(yǎng)元素。因此，每次取樣后補(bǔ)充一定量的N、P及S、K、Ca、Mg、Fe等微量元素調(diào)控營養(yǎng)物質(zhì)。所加谷糠黍糠、麥麩作為添加劑補(bǔ)充其它生物素和營養(yǎng)鹽。表5為試驗(yàn)區(qū)2、對照區(qū)和空白區(qū)中易溶鹽、NH4+、NO3-質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨試驗(yàn)過程的變化，從中可見試驗(yàn)區(qū)于8月21日補(bǔ)充了各種營養(yǎng)元素，反映出隨試驗(yàn)進(jìn)程微生物活動將石油和各類元素利用、降解、轉(zhuǎn)化的過程。表中8月23日至30日土壤含鹽量是增高的，顯示出添加劑的礦化為土壤增加了易溶鹽類元素，該過程驗(yàn)證了本次試驗(yàn)添加的營養(yǎng)元素是比較適度。對照區(qū)、空白區(qū)則反映了自然條件下的變化，降雨使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。

3.3.4 土壤中氧的調(diào)控

環(huán)境條件的調(diào)控包括氧氣的供給，供氧量的多少能影響微生物細(xì)胞內(nèi)許多酶的活性和細(xì)胞的呼吸作用，控制著微生物的生長和對有機(jī)物的降解能力，影響著微生物對污染石油的降解速度。本試驗(yàn)主要從四個方面對土壤氧的供給進(jìn)行了調(diào)控，試驗(yàn)前及每次取樣后均要翻耕試驗(yàn)層，使其充分與大氣混合；其次是土壤具有一定的水分，水中提供的氧；另外添加劑的投加，它不僅為土壤補(bǔ)充營養(yǎng)，而且增大了土壤的蓬松性和通透性。另外，加入 NO3-不僅增加氮源也增加了氧的來源渠道。原因之一。

4 結(jié)論

試驗(yàn)對陜北某油田的石油污染土壤的樣品進(jìn)行菌種、菌群分離、選擇，最終確定假單胞菌屬（Pseudomonas）、微球菌屬（Micrococcus）、放線菌屬（Actinomayces）、真菌類的青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）等菌群。對這些菌群進(jìn)行放大培養(yǎng)，進(jìn)行油污土壤修復(fù)試驗(yàn)研究。兩個試驗(yàn)區(qū)土壤中人為添加石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1542、1886 mg·kg-1時，經(jīng)過11～32 d土著微生物原位修復(fù)，土壤中的石油累計(jì)降解率可達(dá)69.52%～88.11%，而對照區(qū)土壤中人為添加的石油含量變化不大，累計(jì)去除率在20%左右，說明在自然條件下土壤中石油降解是緩慢的。谷糠黍糠、麥麩兩種添加劑對優(yōu)化菌液的修復(fù)效果的作用基本相同。試驗(yàn)說明試驗(yàn)層土壤中石油沒有向下部涂層擴(kuò)散，或少量進(jìn)入的營養(yǎng)物質(zhì)激化了下部土層中的微生物，從而降解了下滲的石油。試驗(yàn)過程中對土壤溫度、水分、氧和營養(yǎng)物質(zhì)等影響因素進(jìn)行了調(diào)控，起到了良好的作用。

本試驗(yàn)驗(yàn)證了土著微生物原位修復(fù)技術(shù)在現(xiàn)場修復(fù)石油污染土壤的試驗(yàn)效果是顯著的，方法是可行的。

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