張 大 范應(yīng)中 王家祥 張 謙

鄭州大學第一附屬醫(yī)院小兒外科 鄭州 450052

辣椒素(capsaicin)是一種自紅辣椒中提取的香草酰胺衍生物。辣椒素膀胱內(nèi)灌注通過降低神經(jīng)原性逼尿肌反射亢進改善尿失禁癥狀。Caterina等用表達克隆分析的方法在大鼠體內(nèi)克隆出了第一個和辣椒素發(fā)生作用的vanilloid受體1,即VRI。高位脊髓損傷后常引起逼尿肌反射亢進,其脊髓中VRI表達有何變化尚不清楚。本試驗研究脊髓橫斷大鼠脊髓中VRI的表達改變,以期了解VRI表達與逼尿肌反射亢進關(guān)系。

1 材料與方法

1.1試劑VRI一抗,兔多克隆 IgG抗體,購自Santa Cruz公司。SP9001免疫組化試劑盒。

1.2實驗?zāi)Ｐ痛菩?SD大鼠 50只,體質(zhì)量 250～280 g。隨機分成5組:模型1周組、2周組、3周組、4周組各10只,假手術(shù)對照組10只。模型組大鼠腹腔內(nèi)注射水合氯醛麻醉,胸段背部正中縱切口,咬除 T8、T9棘突,切除椎板,自T8、T9完全橫斷脊髓后縫合切口。假手術(shù)組僅暴露出脊髓后縫合切口。

1.3術(shù)后處理所有大鼠術(shù)后分籠飼養(yǎng);術(shù)中及術(shù)后5 d內(nèi)腹腔注射氨芐青霉素預防感染,1次/d;術(shù)后1周內(nèi)對所有大鼠均按壓腹部輔助其排尿,早晚各1次;1周后,對模型組大鼠每天刺激尿道及肛門周圍皮膚引發(fā)大鼠排尿,假手術(shù)組大鼠自主排尿。模型組大鼠因感染及腹瀉等因素死亡7例,1周組死亡1例,2周組死亡2例,3周組死亡1例,4周組死亡3例。

1.4標本取材、染色模型組分別在術(shù)后1周、2周、3周、4周取標本。假手術(shù)對照組在術(shù)后2周取標本。取材時用4℃生理鹽水及4%多聚甲醛行主動脈灌注。解剖出脊髓,按照大鼠的脊髓解剖特點,分出各脊髓節(jié)段,分別取L4、L5、L6、S1脊髓節(jié)段,常規(guī)石蠟包埋、4 μ m 切片,免疫組化 SP法染色;每一批染色均設(shè)空白對照。

1.5免疫組化結(jié)果評價用Image J圖像分析系統(tǒng)對免疫組化結(jié)果進行分析,以平均灰度值作為測量指標。測量陽性表達的脊髓后角淺層(I層、Ⅱ?qū)?的平均灰度值記作陽性灰度值,與其相鄰區(qū)域的脊髓灰質(zhì)的平均灰度值記作背景灰度值,以兩者之差的絕對值作為相對灰度值,以相對灰度值作為統(tǒng)計量。

1.6統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(s)表示,應(yīng)用SPSS 10.0分析軟件,對脊髓中VRI表達用兩因素方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1動物術(shù)后一般情況觀察假手術(shù)對照組大鼠手術(shù)后活動自如,可自主排尿,無術(shù)后腹部隆起及泌尿系感染情況;模型組大鼠術(shù)后即出現(xiàn)后肢癱瘓,術(shù)后5 d左右出現(xiàn)后腹部膨隆的腫物,為擴大的膀胱,1～2周開始出現(xiàn)反射性排尿,刺激尿道周圍皮膚可引發(fā)大鼠反射性排尿,同時出現(xiàn)后肢痙攣性癱瘓。

2.2 VRI表達結(jié)果假手術(shù)對照組和各模型組大鼠脊髓L4、L5、L6、S1各節(jié)段中均有 VRI的表達。VRI陽性表達呈棕黃色、深棕色,各節(jié)段陽性表達區(qū)域局限于脊髓后角淺層(I層、Ⅱ?qū)?的神經(jīng)纖維。空白對照片中無VRI陽性染色。各組各脊髓節(jié)段VRI相對灰度值見表 1。

表1 各組及各脊髓節(jié)段VRI表達的相對灰度值 (s)

表1 各組及各脊髓節(jié)段VRI表達的相對灰度值 (s)

組別 L4 L5 L6 S1假手術(shù)對照組 0.489±0.099 0.992±0.128 2.017±0.255 1.518±0.179模型1周組 0.957±0.139 4.391±0.385 23.416±2.550 13.246±1.643模型2周組 2.509±0.342 9.085±1.243 32.885±6.784 21.384±5.306模型3周組 3.328±0.451 10.132±1.870 36.661±5.741 23.847±4.099模型4周組 3.456±0.663 12.050±1.765 40.206±5.691 27.520±6.316

VRI在各脊髓節(jié)段表達不同(F=527.662,P=0.000),兩兩之間比較差異有統(tǒng)計學意義,表達強度依次為L6＞S1＞L5＞L4;各組之間表達差異亦具有統(tǒng)計學意義(F=227.373,P=0.000)。見圖1。

圖1

3 討論

辣椒素具有多種生物學效應(yīng),其生理特性之一是選擇性作用于感覺神經(jīng)系統(tǒng)的外周部分,尤其是C型的初級傳入神經(jīng),可消除自感覺神經(jīng)末梢釋放的P物質(zhì)等神經(jīng)遞質(zhì)刺激所產(chǎn)生的疼痛沖動,被廣泛應(yīng)用于疼痛機制和外周疼痛藥物治療等方面的研究[1]。辣椒素膀胱內(nèi)灌注可增加平均膀胱容量,降低最大膀胱逼尿肌壓力,減輕患者逼尿肌反射亢進及尿失禁癥狀,其治療效果與辣椒素的濃度具有相關(guān)性[2]。

辣椒素與V RI結(jié)合后,VRI通道開放,大量的Ca2+和Na+流入神經(jīng)細胞,而后較高的細胞內(nèi)Ca2+離子水平引起電壓敏感性Ca2+傳導,阻斷重要的代謝通路,釋放聚集在外周神經(jīng)末梢的神經(jīng)肽,如P物質(zhì)和鈣基因相關(guān)肽[3-4]。因此推測,脊髓損傷后神經(jīng)原性膀胱的逼尿肌的高反射性與脊髓VRI表達改變有關(guān)。

術(shù)后假手術(shù)對照組和模型組大鼠 L4、L5、L6、S1四個節(jié)段脊髓后角中均有VRI陽性表達,L6節(jié)段VRI陽性表達最強,S1次之,L5中等表達,L4表達最弱,這說明大鼠膀胱傳入神經(jīng)中C纖維主要傳入L6和S1脊髓節(jié)段,即大鼠脊髓排尿中樞的感覺傳入沖動主要傳至L6和S1脊髓節(jié)段,大鼠膀胱的脊髓感覺中樞位于L6和S1節(jié)段。與其他研究方法得出的結(jié)果相同。

除各脊髓節(jié)段VRI表達有差異外,假手術(shù)對照組和模型組相同一節(jié)段VRI表達也存在差異。說明脊髓橫斷是下位脊髓中VRI表達增強的原因,脊髓損傷后存在某種機制使VRI在膀胱初級傳入神經(jīng)中的表達增加。

脊髓各節(jié)段在脊髓橫斷后V RI的表達增強,并于橫斷后2周左右基本達到較高水平,這個時間與所觀察到的脊髓橫斷后大鼠自發(fā)反射排尿出現(xiàn)的時間相一致;而以前的臨床研究也證實,辣椒素膀胱內(nèi)灌注后患者反射亢進癥狀消失或減輕,由此可以推測脊髓橫斷后大鼠膀胱傳入神經(jīng)中VRI表達的增加可能是逼尿肌反射亢進的原因之一。

VRI陽性表達局限于脊髓后角淺層(I層、Ⅱ?qū)?的神經(jīng)纖維,而后角的神經(jīng)元未見有VRI陽性表達。這說明脊髓中VRI表達的神經(jīng)纖維為感覺神經(jīng)的傳入纖維,而感覺傳入神經(jīng)的二級神經(jīng)元(脊髓后角的神經(jīng)元)無VRI的表達,也就是說VRI表達在初級傳入神經(jīng)上。由此可知VRI參與了初級傳入神經(jīng)元對外周感覺(膀胱傷害性刺激)沖動的傳入。但通過本研究不能確定脊髓后角淺層VRI的合成部位,據(jù)推測可能來自于同節(jié)段脊髓后根神經(jīng)節(jié)細胞。Sanchez等[5]證實在脊髓后根神經(jīng)節(jié)細胞中有VRI RNA分布。也就是說脊髓后角增加的VRI可能來源于同節(jié)段的脊髓后根神經(jīng)節(jié)細胞。因此,脊髓橫斷后大鼠脊髓后角淺層VRI表達增強,可能是膀胱逼尿肌反射亢進的原因之一。

[1]M ark Hayman,Peter CA.Capsaicin:A review of its pharmacology and clinical applications[J].Current Anaesthesia&Critical Care,2008,19:338-343.

[2]Daniel N,Cortright,Arpad Szallasi.The role of the vanilloid and related receptors in nocicepto r function and neuroimmune regulation[J].Neuro Immune Biology,2009,8:101-117.

[3]Szallasi A,Fowler CJ.After a decade of intravesical vanilloid therapy:still more questions than answers[J].Lancet Neurol,2002,1:167-172.

[4]Sanchez JF,Krause JE,Cortright DN.The distribution and regulation of vanilloid receptor V RI and VRI 5'splice variant RNA expression in rat[J].Neuroscience,2001,107(3):373-381.