聞公靈 婁季宇 白宏英

1)河南南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 南陽 473009 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450014

缺血性腦血管病病理過程復(fù)雜。腦缺血再灌注損傷發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制的研究,一直是近年來神經(jīng)科學(xué)的研究熱點(diǎn)。堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)能減少缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,為了解其作用機(jī)制,本實驗通過建立大鼠腦缺血再灌注模型探討bFGF對腦缺血再灌注損傷后熱休克蛋白70(heat shock protein-70,HSP-70)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表達(dá)的影響及其與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組選擇體質(zhì)量為270～320 g的健康SD大鼠,雌雄各半(由河南省實驗動物中心提供),隨機(jī)分成假手術(shù)組,缺血再灌注組,bFGF組,每組 8只。

1.2動物模型制作用體積分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛300 mg·kg-1麻醉,采用 Longa等[1]的線栓法建立大腦中動脈(MCA)閉塞模型。缺血再灌注組及bFGF組均給予缺血1 h再灌注24 h,屆時灌注取腦、固定、脫水、透明、包埋。假手術(shù)組除不插線外,余同上。

1.3給藥方法bFGF為北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司研制,用注射用水稀釋,bFGF組腹腔注射10μ g·kg-1,其余組腹腔注射等量生理鹽水,缺血后即刻給藥。

1.4免疫組織化學(xué)染色檢測HSP-70和Caspase-3采用SABC法石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,過氧化氫封閉,抗原熱修復(fù)20 min,血清封閉,滴加 1∶100兔抗 HSP-70抗體、兔抗Caspase-3抗體(購自中山生物試劑公司),4℃過夜,0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate bufferad satine,PBS)洗,滴加生物素化的羊抗兔IgG 37℃孵育1h,PBS洗,滴加ABC復(fù)合物37℃孵育1 h,PBS液洗,DAB顯色,鏡下控制反應(yīng)時間,雙蒸水終止反應(yīng),脫水、透明、封片、顯微鏡觀察。10×40倍光鏡下,在缺血區(qū)計數(shù)5個視野,計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù),取其均值,以陽性細(xì)胞數(shù)/高倍視野表示。

1.5 T UNEL法原位檢測凋亡細(xì)胞T UNEL試劑盒購自武漢Boster生物工程公司。從每只大鼠的連續(xù)切片中隨機(jī)抽取,參考試劑盒說明書進(jìn)行T UNEL法染色檢測凋亡細(xì)胞。簡述如下:石蠟切片脫蠟至水,0.2%蛋白酶K消化30 min,TdT反應(yīng)液37℃濕盒孵育60 min,生物素化抗地高辛抗體于37℃反應(yīng)30 min,SABC法染色,最后DAB顯色,蘇木素復(fù)染,封片后光鏡觀察。在光鏡400倍視野下在缺血區(qū)計數(shù)5個視野,計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)(鏡下核染色棕黃色),以均值作為陽性細(xì)胞數(shù)。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 12.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示,組間比較采用 t檢驗。取α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1缺血再灌注后各組腦細(xì)胞組織學(xué)變化假手術(shù)組神經(jīng)元形態(tài)正常,結(jié)構(gòu)完整,未見壞死細(xì)胞,無間質(zhì)水腫。缺血再灌注組在基底節(jié),皮質(zhì)下白質(zhì)和皮質(zhì)區(qū)可見明顯梗死灶,神經(jīng)元胞體腫脹核碎裂、溶解,核固縮,胞漿染色變淡細(xì)胞間隙增寬,間質(zhì)水腫明顯。bFGF組梗死灶也位于基底節(jié)及皮質(zhì)下白質(zhì),部分累及皮質(zhì),多數(shù)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較完整,形態(tài)相對正常,間質(zhì)水腫輕。

2.2細(xì)胞凋亡和Caspase-3蛋白檢測結(jié)果光鏡下,凋亡細(xì)胞核呈棕黃色,染色質(zhì)聚集,靠邊形成環(huán)狀、斑塊狀或新月體狀,可見凋亡小體形成;HSP-70及Caspase-3陽性細(xì)胞胞漿呈棕黃色,三者主要分布于梗死灶邊緣區(qū)。假手術(shù)組偶見凋亡細(xì)胞HSP-70和Caspase-3陽性細(xì)胞,bFGF組凋亡細(xì)胞數(shù)和Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于缺血再灌注組(P＜0.05和P＜0.05),bFGF組hsp-70陽性細(xì)胞數(shù)明顯較缺血再灌注組增加(P＜0.05)。見表1。

表1 2組凋亡細(xì)胞和Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)比較

3 討論

神經(jīng)細(xì)胞死亡是腦梗死的病理基礎(chǔ)。近年來研究發(fā)現(xiàn),腦缺血再灌注損傷可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。大鼠缺血再灌注30 min即可出現(xiàn)細(xì)胞凋亡,24～48 h凋亡的細(xì)胞最多,可一直持續(xù)到28 d[2]。本實驗觀察到,缺血1 h再灌注24 h,缺血區(qū)可見成簇核被染成棕黃色的凋亡細(xì)胞。

Caspase-3是Ced-3相關(guān)半胱氨酸蛋白酶,被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過程中最重要的蛋白酶,是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路[3]。有研究發(fā)現(xiàn),缺血可使腦組織Caspase-3表達(dá)增加,Caspase-3過度表達(dá)可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡[4],在缺血性神經(jīng)損傷過程中,抑制Caspase-3活性可產(chǎn)生明顯的神經(jīng)保護(hù)作用[5]。本實驗應(yīng)用免疫組化法觀察缺血1 h再灌注24 h皮質(zhì)區(qū)Caspase-3的表達(dá),發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組在相當(dāng)于損傷區(qū)皮質(zhì),偶見Caspase-3陽性細(xì)胞,缺血再灌注組Caspase-3陽性細(xì)胞明顯增多且與凋亡細(xì)胞分布一致。雖然bFGF組Caspase-3陽性細(xì)胞仍較多,但較缺血再灌注組相比,明顯減少(P＜0.05),提示bFGF能通過抑制Caspase-3的表達(dá)而減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

bFGF是一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子,廣泛分布于成熟和未成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi),通過與其相應(yīng)受體結(jié)合發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。Li等[6]在大鼠MCAO后2 h,靜脈給予bFGF,缺血24 h區(qū)皮質(zhì)梗死面積縮小32%,且神經(jīng)功能缺損癥狀明顯改善。Sugimori等[7]研究bFGF對缺血腦組織的遠(yuǎn)期影響,發(fā)現(xiàn)bFGF能使大鼠pMCAO 3個月后腦組織梗死體積降低27%。我們的實驗觀察到bFGF能使缺血區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)顯著減少(P＜0.05),改善缺血區(qū)腦組織病理學(xué)變化,減輕腦水腫。但其作用機(jī)制尚不十分明了。

HSP-70是一類應(yīng)激保護(hù)性蛋白,正常腦組織HSP-70含量極少,當(dāng)受到有害刺激時,受損細(xì)胞內(nèi)的變性蛋白可誘導(dǎo)HSP-70表達(dá)[8]。腦缺血再灌注后HSP-70表達(dá)上調(diào)是神經(jīng)元遭受可逆性損害的一種代償性修復(fù)機(jī)制,其表達(dá)水平被認(rèn)為是細(xì)胞受損敏感的指標(biāo)。本實驗結(jié)果表明:腦缺血再灌注后24 h,腦缺血再灌注區(qū)HSP-70陽性細(xì)胞明顯增多。bFGF組與缺血再灌注組之間在HSP-70陽性細(xì)胞表達(dá)上存在明顯的變化,bFGF提高了HSP-70的表達(dá)。實驗觀察到bFGF組病灶區(qū)多數(shù)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較完整,形態(tài)相對正常,間質(zhì)水腫輕,提示HSP-70在腦缺血再灌注損傷后應(yīng)激保護(hù)作用中起到重要作用,bFGF能有效上調(diào)HSP-70的表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡,減輕腦組織損傷,增強(qiáng)細(xì)胞對缺血再灌注的耐受性。HSP-70抗細(xì)胞凋亡作用的具體機(jī)制較復(fù)雜,尚需進(jìn)一步研究,抑制Caspase-3的活化可能是其作用之一。

[1]Longa EZ,Weinsein P R,Canson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion with craniectony in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[2]M allei A,Aden SA,Bachis A,et al.The nitrosteroid NCX 1015,a prednisolone derivative,improves recovery of function in rats after spinal cord injury[J].Brain Res,2005,1062(1/2):16-25.

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[5]Li Q,Stephenson D.Postischemic administration of basic fibroblast g rowth factor improves senso rimoter function and reduces infarct size following permanent focal cerebral ischemia in the rat[J].Exp Neurol,2002(2),177:531-537.

[6]Sugimori H,Speller H,Finklestein SP.Intravenous basic fibroblast growth factor produces a persistent reduction in infarct volume following permanent focal ischemia in rats[J].Neurosci Lett,2001,300(1):13-16.

[7]盧艷秋,婁季宇,白宏英,等.托吡酯對大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡和HSP-70表達(dá)的影響[J].中國實用神經(jīng)疾病雜志,2007,10(3):86-88.