孫玉華 盧 宏

1)河南大學(xué)淮河醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 開封 475000 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

丁苯酞,其活性成分為dl-3-正丁基苯酞,其左旋體存在于芹菜籽中[1]。多年的動物實驗研究證明,丁苯酞對缺血性卒中具有較好的治療作用[2]。丁苯酞能否治療血管性癡呆給人們提出了新思路。根據(jù)文獻報道,大鼠雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎后能造成大鼠明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙[3],本實驗通過建立VD動物模型,應(yīng)用水迷宮、透射電鏡及免疫組化方法對各組大鼠學(xué)習(xí)記憶、神經(jīng)元結(jié)構(gòu)、nNOS表達進行觀察,探討丁苯酞對VD的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 動物:均選用 14～15月齡的健康SD大鼠100只,體質(zhì)量450～550 g,由河南省實驗動物中心提供。

1.1.2 藥物及試劑:丁苯酞:批號:050106。nNOS多克隆抗體和SP試劑盒來自博士德公司。

1.2動物模型的建立及分組與給藥

1.2.1 動物模型的建立:根據(jù)Olsson方法[4]結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈。假手術(shù)組分離但不結(jié)扎頸總動脈。

1.2.2 動物分組與給藥方法:將造模成功的VD大鼠隨機分為模型組(MDG)、丁苯酞高劑量組(DBT1)及丁苯酞低劑量組(DBT2),加上假手術(shù)組(SOG)及丁苯酞預(yù)防組(DBT3)共5組。DBT1及DBT2組造模后第61天開始治療,分別灌服丁苯酞12 mg/100 g/d、6 mg/100 g/d;MDG和SOG以等量消毒花生油灌胃;DBT3組術(shù)前30天灌服丁苯酞8 mg/100 g/d;各組均每日1次給藥,連續(xù)給藥30 d。

1.3癡呆標(biāo)準(zhǔn)以假手術(shù)組大鼠逃避潛伏期的平均值作為參考值,計算結(jié)扎大鼠逃避潛伏期的平均值與參考值之差占該鼠逃避潛伏期的比值,若該值大于20%為癡呆鼠。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的測定:參照 Morris水迷宮[5]行定位航行實驗及空間搜索實驗術(shù)后61 d按上述方法進行學(xué)習(xí)記憶測試,按癡呆標(biāo)準(zhǔn)判定VD模型。治療后第31天再進行水迷宮測試。

1.4.2 電鏡標(biāo)本的制備:大鼠斷頭處死后,參照大鼠腦圖譜,迅速切取右側(cè)海馬區(qū)組織塊,迅速放入預(yù)冷4℃的4%的戊二醛中固定,常規(guī)脫水、Epon812環(huán)氧樹脂包埋,LKB超薄切片,醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色,日立H-7500型透射電鏡觀察。

1.4.3 免疫組化染色:按常規(guī)操作進行。

1.5定量分析計數(shù)在海馬區(qū)選擇3個相鄰視野,在400倍光鏡下作免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元計數(shù),結(jié)果取3個視野的平均值。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示,然后運用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA),多個樣本均數(shù)的兩兩比較用q檢驗法。α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 實驗結(jié)果

2.1各組大鼠水迷宮實驗學(xué)習(xí)記憶成績比較表1。

2.2透射電鏡觀察假手術(shù)組可見神經(jīng)元細胞器結(jié)構(gòu)正常;模型組可見神經(jīng)細胞高度水腫,細胞核變性,線粒體腫脹,嵴的雙層膜結(jié)構(gòu)不清、斷裂、萎縮,正常線粒體少見;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嚴(yán)重脫顆粒。大劑量丁苯酞組鏡下觀察神經(jīng)元正?；蜉p度異常,可見次級溶酶體,線粒體,高爾基體神經(jīng)細胞線粒體嵴清晰,正常線粒體多見;小劑量丁苯酞組及預(yù)防組可減輕神經(jīng)細胞變性及線粒體等細胞器的異常變化。

表1 各組大鼠逃避潛伏期及跨平臺次數(shù)比較

2.3各組海馬nNOS陽性細胞表達的比較表2。

表2 各組海馬nNOS及SS陽性細胞表達的比較

3 討論

本實驗大鼠的逃避潛伏期及跨平臺次數(shù)變化提示模型組大鼠發(fā)生學(xué)習(xí)記憶障礙,電鏡提示模型組大鼠發(fā)生細胞變性水腫,不同劑量丁苯酞治療后大鼠學(xué)習(xí)記憶改善,細胞變性水腫減輕。這與以往研究[6]丁苯酞改善腦缺血狀態(tài)一致。

人們發(fā)現(xiàn)了海馬突觸傳遞的長時程增強(long term potential,LTP)現(xiàn)象,這種突觸傳遞的可塑性變化與學(xué)習(xí)記憶如此相似,使得人們自然把海馬作為研究學(xué)習(xí)記憶的首選靶位。研究表明,一氧化氮(nitric oxide,NO)很可能就是 LTP得以產(chǎn)生的關(guān)鍵信使[7],用多種離體或在體實驗手段干擾大鼠海馬區(qū)NO的水平,都會使LTP和學(xué)習(xí)記憶能力受到影響[8],由此反推,癡呆時海馬區(qū)NO的水平會有所變化。因為NO的生物半衰期極短,常用NOS的表達表示NO的活性[9]。腦內(nèi)NOS至少有三型[10]:神經(jīng)元型NOS(nNOS)、誘導(dǎo)型NOS(iNOS)和內(nèi)皮型 NOS(eNOS)。Huang等[11]確定了nNOS的神經(jīng)毒性作用。本實驗顯示,慢性缺血各組大鼠nNOS表達的陽性細胞數(shù)均有不同程度升高,這與王金蘭的研究不一致。丁苯酞治療可明顯對抗慢性腦缺血時nNOS活性的升高,減輕其神經(jīng)毒性作用。

至于丁苯酞的作用機制,可能十分復(fù)雜,丁苯酞抑制大鼠腦組織中nNOS的過度表達,減輕細胞變性水腫,可能是丁苯酞治療VD的神經(jīng)生化基礎(chǔ)之一。

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