胡成伍 夏加琴 吳家冪

1)湖北潛江市中心醫(yī)院 潛江 433100 2)安徽蕪湖市第一人民醫(yī)院 蕪湖 241000 3)皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院 蕪湖241001

關于腦缺血再灌流期間高熱對腦缺血損傷的作用,迄今國內外研究結果不一致[1-2]。本工作在大鼠局部腦缺血再灌注不同時間點給予短暫高熱,探討高熱對缺血性腦損傷的作用,為臨床對急性腦卒中患者的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗分組健康雄性Sprague-Dawley大鼠66只,鼠齡3～4個月,體質量 275～325 g,由南京青龍山實驗動物養(yǎng)殖中心提供。動物隨機分為3組:假手術(Sham)組(n=6),缺血再灌注后正常體溫組(normathermia,NT)組(n=30),缺血再灌注組后高熱(hyperthermia,HT)組(n=30)。CIR后NT組和HT組分別按12 h后、24 h后、48 h后、72 h后、120 h后再各分5個亞組(n=6)。假手術組再分為NT和HT)2個亞組(n=3)。

1.2大鼠局部腦缺血再灌流模型的制備參照Zea Lon-ga[3]方法制備大鼠腦缺血再灌流模型,腦缺血2 h后將尼龍絲線拔出,退至頸外動脈內恢復再灌流,假手術組插尼龍線深度為小于10 mm。扎緊備線,外留10 mm長線頭,縫合皮膚。手術全過程應用100W 燈泡照明,調節(jié)燈泡至大鼠的距離,以保持大鼠肛溫為(37.0±0.5)℃。插入栓線2h后,回抽栓線使其頭端回到頸外動脈內,恢復頸內動脈血流,實現(xiàn)再灌注。

1.3大鼠體溫調控參照L.A.Favero-Filho等[4]的實驗方法使用100 W白熾燈及恒溫控制器升高大鼠肛溫。期間大鼠自由飲水。加溫干預時間分別為 CIR11 h、23 h、47 h、71 h、119 h后。加溫時間為1 h。大鼠 CIR模型成功后,每隔12 h測量體溫,升高體溫干預開始后每隔15 min測量大鼠肛溫。保持大鼠肛溫39.0～39.5℃。如果大鼠在加溫前和常溫組大鼠在各時間點前出現(xiàn)體溫異常(＜37.0℃或＞38.0℃)則被剔除。

1.4神經(jīng)功能缺損評分及模型成功標準模型成功的標準以Zea Longa 5分法[3]為評分標準:0分,無神經(jīng)缺損癥狀;1分,提尾時癱側前肢內收,不能完全伸直;2分,行走時向癱側傾倒;3分,行走時向癱側旋轉;4分,不能行走或昏迷。評分為1～3分者為成功模型。未達到上述標準者視為模型制作失敗,不計入實驗組。因麻醉未清醒者以及清醒后死亡經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)存在蛛網(wǎng)膜下腔出血的也視為模型制作失敗不計入實驗組。

1.5腦梗死體積測定及免疫組化染色取大鼠腦組織后,從視交叉前緣始向后作2 mm厚冠狀位腦組織塊,將除紋狀體平面外的腦組織置于2%TTC染色,再用4%多聚甲醛固定3～5 h后的腦組織數(shù)碼相機(微距,且用三角架固定焦距)拍取照片,然后采用計算機圖像分析軟件計算大鼠腦梗死體積。紋狀體平面的腦組織的梗死體積的取其相鄰兩個腦片梗死體積之和的平均值[5]。將紋狀體平面腦組織切片制成蠟塊。腦組織蠟塊標本進行5 μ m厚的連續(xù)切片。每間隔5片選1片行常規(guī)HE染色,光鏡下觀察形態(tài)學改變。剩余切片用兔抗鼠多克隆抗體ALOX5ABC(武漢博士德公司提供)免疫組化染色。

1.6統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)正態(tài)資料以均數(shù)±標準差表示,應用SPSS 11.5軟件進行資料處理,2組均數(shù)間比較t檢驗,方差不齊時,用Tamhane's T2檢驗。雙變量關系采用直線相關分析,非正態(tài)資料使用Mann-Whitney U檢驗,檢驗水準均為α=0.05。

2 結果

2.1神經(jīng)功能缺損評分CIR后NT組和CIR后HT組各時間點神經(jīng)功能缺損評分與假手術組相比明顯增加,比較都有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。CIR后N T組大鼠清醒后出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀,12 h后癥狀進展,24 h后繼續(xù)發(fā)展、48 h后最嚴重,3個時間點神經(jīng)功能缺損評分差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。CIR NT組大鼠神經(jīng)功能缺損評分自72 h后即下降。CIR HT組12 h、24 h、48 h的神經(jīng)功能缺損評分較CIR NT組相應時間點增加,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。CIR HT組72h、120h的神經(jīng)功能缺損評分較 CIR NT組相應時間點增加,但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評分比較

2.2腦缺血再灌注后高熱對梗死體積和梗死灶周邊皮質5-LO表達的影響CIR后NT組和CIR后HT組梗死體積與假手術組相比明顯增加,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。CIRNT組72 h后梗死體積逐漸減少,120 h后梗死體積最小。雖然CIR NT組72 h、120 h梗死體積較 HT組 72 h、120 h增加,但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。假手術HT組和NT組紋狀平面腦組織有少量5-LO表達,主要位于神經(jīng)元細胞內,為棕黃色顆粒,細胞形態(tài)正常。CIR NT組和HT組12 h、24 h、48 h后梗死中心,都有少量 5-LO陽性神經(jīng)元細胞存在,半暗帶皮質可見5-LO陽性神經(jīng)元細胞明顯增多,胞漿及胞膜均有5-LO表達,但以胞漿明顯。

表2 5-LO表達與梗死體積 (mm3,s)

表2 5-LO表達與梗死體積 (mm3,s)

注:HT與 NT比較,*P＞0.05,兩兩比較,△P＜0.05;HT、NT分別與假手術組比較,◆P＜0.05;r=0.649,P＜0.05

n 高熱組(HT)常溫組(NT)5-LO 梗死體積(mm3)5-LO 梗死體積(mm3)假手術組 3 0.83±0.07 0.00±0.00 0.81±0.05* 0.00±0.00*CIR12 h 6 12.03±2.04△◆ 134.27±15.60△◆ 6.33±1.37◆ 72.33±16.60◆CIR24 h 6 18.00±2.03△◆ 174.48±18.20△◆ 11.17±1.47◆ 97.90±3.88◆CIR48 h 6 16.33±1.75△◆ 178.33±10.16△◆ 11.33±1.75◆ 119.83±17.77◆CIR72 h 6 6.03±1.17*◆ 90.75±17.44*◆ 7.83±1.72◆ 93.23±18.43◆CIR120 h 6 5.66±2.52*◆ 57.18±18.33*◆ 5.83±2.32◆ 70.43±13.48◆

CIR HT組和NT組分別與假手術組相比腦組織5-LO陽性神經(jīng)元細胞數(shù)增加,有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。CIR HT組12 h、24 h、48 h后半暗帶皮質5-LO陽性神經(jīng)元細胞數(shù)較CIR NT組相應時間點增加顯著(P＜0.05)。CIR HT組72 h、120 h后半暗帶皮質神經(jīng)元細胞雖然仍有5-LO表達,但較CIR NT組相應時間點增加不明顯(P＞0.05)。CIR后缺血灶周邊神經(jīng)元5-LO與梗死體積存在正相關(r=0.649,P＜0.05)見表2。

3 討論

腦血管疾病是目前危害人類健康的三大疾病之一。其中缺血性腦血管疾病以其高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率而嚴重危害人們的身體健康。臨床中常發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中后患者體溫升高,體溫升高的原因主要為感染,其次為缺血性腦卒中影響下丘腦體溫中樞而引起體溫升高[6]。

結果發(fā)現(xiàn)CIR HT組神經(jīng)功能缺損評分12 h、24 h、48 h后組比NT組相對應時間點增加;CIR HT組72 h、120 h后較NT組神經(jīng)缺損評分雖有增加,但無統(tǒng)計學意義。因為神經(jīng)功能缺損與損傷范圍并非總是相關[7],因此本實驗又采用另一更加直接的指標—腦梗死體積來觀察大鼠CIR后高熱對腦組織的影響。HT組和NT組12 h后見明顯梗死病灶,24 h后體積逐漸增大,48 h后梗死體積達到高峰。72 h后梗死體積逐漸減少,120 h后梗死體積最小。HT組12 h、24 h、48 h梗死體積較NT組相應時間點明顯增加,通過HT組與NT組之間梗死體積的比較更加說明缺血性腦卒中48 h內高熱可加重腦損傷。其原因可能由于短暫腦缺血再灌流早期腦缺血細胞的結構和功能尚未完全恢復,此時再灌流損傷及高溫的共同作用使許多可逆的腦缺血細胞進入不可逆狀態(tài),增加腦梗死體積,在再灌流晚期,再灌流損傷作用的減弱或消失,缺血半暗帶中可逆狀態(tài)的缺血腦細胞基本恢復了正常功能,可通過自身保護機制抵御高熱造成的損傷,因此隨再灌流時間的延長,高熱對腦缺血損傷的作用趨于不明顯。高熱對大鼠CIR后加重腦損傷的機制可能有:①高熱能通過辣椒素受體3(Transient receptor potential vanilloid 3,TPRV3)引起細胞內鈣超載,加重神經(jīng)損傷。Xu H等[8]報道當溫度從22℃升高到40℃,TRPV3可被激活,并在一定范圍內隨溫度升高電流增大。已有研究表明高熱刺激通過TRPV3受體引起鈣內流[9]。②腦卒中后的高熱可促進氨基酸遞質的釋放。③腦卒中后的高熱可使氧自由基增多,可加重血腦屏障的損害[10]。

雖然高熱可能通過以上機制加重腦損傷,但是其具體機制仍不清楚。最近研究發(fā)現(xiàn)5-LO與腦缺血再灌注損傷有密切關系。Manu Jatana等[11]研究使用5-LO抑制劑BW-B 70 C和AA-861作為干預后發(fā)現(xiàn)5-LO抑制劑干預組大鼠局灶性腦缺血再灌注24 h后梗死體積較對照組縮小、神經(jīng)功能缺損評分改善。該研究雖然說明5-LO可以加重腦缺血再灌注損傷,但一直以來,CIR后高熱與5-LO之間的關系研究較少。本實驗中假手術HT組腦組織神經(jīng)元5-LO表達很少,與假手術NT組相比沒有增加,說明短暫高熱對正常腦組織的影響較小。而且HT組12 h、24 h、48 h時缺血灶周邊神經(jīng)元5-LO表達比NT組明顯增加;CIR72 h后NT組比HT組缺血灶周邊神經(jīng)元5-LO表達雖有增加,但無統(tǒng)計學意義。實驗結果說明高熱能使CIR48 h內缺血灶周邊神經(jīng)元5-LO表達增加,同時提示大鼠CIR后缺血灶周邊神經(jīng)元5-LO表達能夠加重腦損傷,而且5-LO表達越多,梗死體積越大,二者之間存在正相關。解釋這一結果的可能原因為隨著再灌注時間延長,CIR后缺血半暗帶逐漸減少,這樣CIR48 h后缺血灶周邊神經(jīng)元對高熱等傷害性刺激無反應,5-LO表達減少,所以高熱對大鼠CIR后加重腦損傷的時間窗為CIR后48 h內。高熱使缺血灶周邊神經(jīng)元5-LO表達雖有增加的機制可能為①高熱能通過TPRV3受體引起細胞內鈣內流,而鈣離子能夠誘導5-LO膜聚集。而細胞內鈣離子超載可以能夠誘導5-LO膜聚集。②高熱能促進蛋白激酶及其磷酸化活化[12]。P38蛋白激酶被磷酸化活化,并通過磷酸化活化轉錄因子調控特定基因的表達,繼而可在細胞內鈣參入下激活5-LO。

雖然高熱可能通過上述途徑促進缺血性腦卒中后5-LO表達進而加重腦損傷,但是否存在其他途徑有待進一步研究。盡管如此,臨床上缺血性腦卒中如果患者出現(xiàn)高熱(48h內),都應該給予積極的干預以減少患者腦損傷。

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