北京中檢維康技術有限公司 王 雄 王艷斐 果 旗 榮 釗 陳冰君

長江大學生命科學學院 王 麗

中國原子能科學研究院 吳繼宗

目前，黃曲霉毒素（AFT）的檢測方法主要有薄層層析法、色譜法和微管柱篩選法等 （張藝兵等，2006）。這些方法因精確度低、敏感性差；樣品前處理過程復雜費時；或需要價格昂貴的儀器，檢測成本高，難以推廣應用，影響了飼料中黃曲霉毒素的有效監(jiān)測。酶聯免疫吸附法（ELISA）是在免疫學和細胞工程學基礎上發(fā)展的一種微量檢測技術，特別適合對黃曲霉毒素污染監(jiān)控中大量樣本的篩檢（路戈和計融，1996）。本研究以B細胞雜交瘤技術，以能分泌抗黃曲霉毒素單克隆抗體的雜交瘤細胞株為基礎，建立了一種高效、準確、簡便、適用于大批量樣品篩選的定性、定量的用于檢測飼料中黃曲霉毒素的ELISA檢測方法。

1 基本原理

酶聯免疫法是以抗體和抗原的特異性結合為基礎的，以酶或者輔酶作為標記物，標記抗原，用酶促反應的放大作用來顯示初級免疫學反應。本實驗最大的特點就是利用聚苯乙烯微量反應板，吸附抗抗體，使之固相化，加樣品提取液和酶標AFT抗原 （AFT與辣根過氧化物酶的結合物），在酶標板內進行酶促反應。加底物（TMB）顯色，顏色的深淺取決于抗體和酶標抗原的結合量。樣品中黃曲霉毒素多，則被抗體結合的酶標抗原就少。在辣根過氧化物酶存在下，底物與其反應，顯藍色，硫酸終止后顯黃色。用酶標儀讀數，用專用軟件分析，即可得出黃曲霉毒素的含量。

2 材料與方法

2.1 儀器和試劑

2.1.1 主要儀器 酶標分析儀 （Thermo Labsystems），高速離心機（北京時代北利離心機有限公司），電子分析天平（Mettler Toledo），電熱恒溫培養(yǎng)箱 （天津市中環(huán)實驗電爐有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司）；潔凈臺（天津科學儀器廠）；生物倒置顯微鏡（日本歐林巴斯光學株式會社）等。

2.1.2 試劑 抗黃曲霉毒素B1雜交瘤細胞株（北京中檢維康技術有限公司研制）；HRP標記黃曲霉毒素（北京中檢維康技術有限公司研制）；黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、T-2毒素、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、牛血清白蛋白（BSA）、伏馬菌素B1等（均購自Sigma公司）。

2.2 單克隆抗體制備 將抗黃曲霉毒素B1雜交瘤細胞注入BALB/c小鼠腹腔，獲得含抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體的腹水，并將所得腹水采用飽和硫酸銨鹽析法進行純化（路戈和計融，1996）。

2.3 抗體特性鑒定

2.3.1 單克隆抗體效價的測定 應用間接ELISA法測定純化后的單克隆抗體的效價。判定標準：以腹水OD值除以SP2/0腹水OD值大于或等于2的最高稀釋倍數為腹水效價。

2.3.2 單克隆抗體特異性的測定 選擇嘔吐毒素、赭曲霉毒素A、伏馬菌素B1、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、牛血清白蛋白（BSA），將不同濃度上述毒素替代黃曲霉毒素標準品溶液，應用直接ELISA法測定其標準曲線，計算出50%抑制濃度（IC50），并計算交叉反應率。計算公式如下：

2.4 試劑盒各項技術參數研究

2.4.1 抗抗體與單抗、酶標抗原最適工作濃度的確定 采用方陣法確定抗抗體、單抗及酶標抗原的最適工作濃度，每板同時設陰性對照。判斷標準：選擇OD值在1.5左右時，包被抗抗體濃度、單抗以及酶標抗原濃度為最適工作濃度。

2.4.2 標準曲線的建立 采用直接競爭ELISA方法建立標準曲線，選擇合適的標準品濃度，以無黃曲霉毒素抑制時的OD值為B0值相應濃度黃曲霉毒素抑制時的OD值為B值，百分吸光度值（B/B0）為縱坐標，以標準品的濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2.5 實驗方法

2.5.1 樣品前處理

2.5.1.1 稱取5 g樣品，加入25 mL樣品提取液（70%甲醇水），劇烈振蕩3 min（用手或振蕩器）。2.5.1.2 將提取液用普通濾紙過濾，取3 mL稀釋液加入3 mL正己烷，振蕩1 min，3000 r/min離心2 min去上層，取下層以稀釋緩沖液按1∶1的比例稀釋（吸取 500 μL 濾液，加入 500 μL 稀釋液緩沖液），該液為待測液。樣本稀釋倍數為10倍。

2.5.2 測定步驟

2.5.2.1 酶標板的制備：以pH 7.2的磷酸鈉鹽緩沖溶液作為包被緩沖液，將抗體稀釋到最佳工作濃度，每孔加入200 μL，37℃溫育2 h或4℃過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌4次，每次30 s，拍干，然后在每孔中加入200～250 μL 0.7%的明膠封閉液，37℃溫育1～2 h，傾去孔內液體拍干，干燥后用鋁箔袋真空密封保存。

2.5.2.2 將足夠標準品和樣品所用數量的孔條插入酶標板架，標準品和樣品做2個平行實驗，記錄下標準品和樣品的位置。未使用的酶標板用鋁箔袋封好置2～8℃冷藏保存。

2.5.2.3 分別將標準品和樣品加至相應的微孔（雙孔）中，然后再各加入稀釋后的酶標抗原，最后加入稀釋后的抗體，加蓋，在37℃溫育10 min（每個標準和樣品必須使用新的吸頭）。

2.5.2.4 倒出孔中的液體，然后每孔加入洗滌液洗滌，重復操作4次，洗完后用力在吸水紙上拍干。

2.5.2.5 加入顯色液，37℃避光溫育15 min。

2.5.2.6 加入硫酸終止液，終止反應。

2.5.3 結果判定 結果的判定方法：所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個標準（0標準）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。

以黃曲霉標準品濃度值（μg/kg）為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。相對應每一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計算出樣本溶液濃度。利用計算機專業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。

樣品的實際濃度為讀數結果乘以稀釋倍數。

2.5.4 回收率實驗 根據試劑盒的檢測范圍確定加標濃度，在不含黃曲霉毒素的三樣品中分別進行 5、10、20 μg/kg 三個濃度的加標回收實驗，每個加標水平做4個重復的平行樣。樣品按照2.5.1提取方法進行提取，待測液用ELISA進行檢測。

2.6 試劑盒穩(wěn)定性實驗 對試劑盒穩(wěn)定性采用37℃加速破壞實驗進行研究，將試劑盒分別放置于4℃和37℃，每隔24 h進行ELISA測定，測定陰性對照（不加毒素B0）和陽性（即50%的抑制毒素濃度B）的吸光度（A）值，計算兩者的比值（B/B0）。 當 B0<0.6 個吸光度（A）值，或 B/B0<0.7A時，即可判定ELISA試劑盒已失效。在37℃放置24 h相當于在4℃放置45 d。從試劑盒的生產日期到失效日期的時間可確定為ELISA試劑盒的穩(wěn)定周期，即保質期。

3 結果分析

3.1 單克隆抗體特性鑒定 雜交瘤細胞株產生的腹水抗體經純化后，抗體效價約為1∶30000，抗體的工作濃度為1∶20000。抗體與T-2毒素、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬菌素B1等其他真菌毒素和牛血清白蛋白的交叉反應均小于0.1%。

3.2 試劑盒技術參數 根據方陣法確定，抗體的最適工作濃度為1∶20000，黃曲霉羊抗鼠抗體的最適包被濃度為 1∶5000，酶標抗體濃度為 1∶7000。標準曲線中黃曲霉毒素的濃度分別為 0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL， 最低檢出濃度是 0.5 ng/mL，標準曲線方程為y=-7.5x+88.6，R=0.995，線性范圍為0.5～10.0 ng/mL，50%的抑制濃度為1.5 ng/mL左右。

3.3 回收率測定 對花生及制品做黃曲霉毒素的回收率實驗，加標濃度分別為 5、10、20 μg/kg。其加標回收率的范圍為70%～110%，具體見表1。

表1 花生樣品中回收率實驗結果

3.4 試劑盒穩(wěn)定性試驗 經37℃穩(wěn)定實驗，試劑盒能在37℃下存放150 h后，陰性對照吸光度值為0.75，仍然大于0.6。所以該試劑盒有效期能達到6個月。

4 討論

因為ELISA是利用抗體的選擇性和標記酶的化學放大的靈敏性建立起來的，故應考慮的因素主要有以下幾方面（Richard 等，1994）：（1）抗體包被：將抗抗體固定在聚苯乙烯微量反應板中稱為包被，包被的質量是影響抗原、抗體反應的重要因素。（2）非特異性反應：ELISA中會發(fā)生許多非特異性反應，嚴重干擾分析結果，選擇適合的抗原、抗體組合，可以明顯的減少這種反應的發(fā)生。（3）酶和抗原的偶聯：酶和抗原偶聯的好壞，直接影響試劑靈敏度。本實驗操作時采用的是辣根過氧化物酶與抗原偶聯CMO的方法。（4）底物：當酶標記抗原-抗體復合物與底物相遇時，復合物中的酶水解底物，是無色的底物溶液生成有色的反應產物。因此，應注意底物溶液的避光性。（5）洗滌：酶促反應，每次反應后都需反復洗滌，這既保證了反應定量關系，也除去了血清中與反應無關的其他成分及游離的復合物等。洗滌效果與檢測結果密切相關。如果洗滌不充分，常引起結果的紊亂，最好做到洗滌的步驟標準化。

5 小結

本研究在制備出針對黃曲霉毒素有較好的靈敏度，在特異性抗體和酶標抗原基礎上，研制出對飼料中黃曲霉毒素的ELISA快速檢測試劑盒。該試劑盒最低檢出濃度為0.5 μg/kg，對樣品的檢測范圍為5.0～100 μg/kg，試劑盒所用單克隆抗體與其他真菌毒素均無交叉反應，具有較高的特異性。對花生及花生粕做添加回收率實驗結果為70%～110%，重復性和再現性良好，在2～8℃條件下可以保存6個月。以上技術參數均達到試劑盒的技術要求，而且具有簡單、快速、靈敏、準確、特異性好，并可同時檢測大量樣品等優(yōu)點，值得推廣應用。

[1]路戈，計融.食品中黃曲霉毒素B1單克隆抗體酶聯免疫測定方法的建立及初步應用[J].衛(wèi)生研究，1996，5（3）：162 ～ 165.

[2]張藝兵，鮑蕾，禇慶華，等.農產品中真菌毒素的檢測分析[M].北京：化學工業(yè)出版社，2006.1～6.

[3]Richard J Cole，Joe W.Dorner.Extraction of aflatoxin from Naturally contaminated peanuts and solvent peanut rations[J].J AOAC，1994，77（6）：1509 ～1511.