揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 劉 翔 張紅偉 董淑紅 王洪榮＊ 熊 浩

反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)的微生物既能降解代謝粗飼料資源供宿主動(dòng)物利用，又是宿主動(dòng)物的優(yōu)質(zhì)微生物蛋白飼料源，他們對(duì)緩解資源緊缺、節(jié)約蛋白質(zhì)飼料、保持畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展有重要的意義。反芻動(dòng)物對(duì)氮源的利用效率較低 （0%～35%）（Lobley，1992），而瘤胃內(nèi)原蟲(chóng)對(duì)細(xì)菌的吞噬是造成瘤胃內(nèi)微生物蛋白（MCP）再循環(huán)、氮利用效率低下的主要因素之一。反芻動(dòng)物日糧的組成不同，會(huì)通過(guò)影響瘤胃發(fā)酵而影響原蟲(chóng)群體。如飼喂大量精料后瘤胃pH值可能降至6.0以下，原蟲(chóng)將全部消失（Brown 等，2006；Franzolin 等，1996）；不同結(jié)構(gòu)日糧顯著影響瘤胃內(nèi)原蟲(chóng)種群結(jié)構(gòu) （王夢(mèng)芝等，2007）。而這些由于日糧帶來(lái)的原蟲(chóng)的變化除了直接影響MCP產(chǎn)量外；還將不可避免地影響原蟲(chóng)對(duì)細(xì)菌的吞噬，即通過(guò)影響瘤胃微生態(tài)的微生物循環(huán)而間接影響MCP量、氨基酸組成和氮利用效率，這也是利用反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)生理特點(diǎn)，通過(guò)調(diào)節(jié)飼料類(lèi)型以達(dá)到調(diào)控消化道氮素營(yíng)養(yǎng)的契機(jī)之一。

近些年來(lái)，隨著同位素示蹤技術(shù)在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)上的不斷發(fā)展和應(yīng)用，尤其是利用穩(wěn)定性同位素15N研究含氮物質(zhì)在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的吸收、利用和循環(huán)，已成為一個(gè)研究的熱點(diǎn)。本試驗(yàn)擬以不同精粗比底物條件下瘤胃原蟲(chóng)與細(xì)菌間蛋白的周轉(zhuǎn)規(guī)律為研究目標(biāo)，以瘤胃原蟲(chóng)對(duì)細(xì)菌的吞噬速率及吞噬量為研究重點(diǎn)，采用穩(wěn)定性同位素標(biāo)記示蹤技術(shù)，測(cè)定不同精粗比底物條件下山羊瘤胃原蟲(chóng)對(duì)細(xì)菌的吞噬速率，探討底物精粗比對(duì)微生物蛋白微循環(huán)量和細(xì)菌周轉(zhuǎn)率的影響規(guī)律，為通過(guò)日糧類(lèi)型調(diào)控微生物蛋白，進(jìn)而提高反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能和蛋白質(zhì)飼料利用效率提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 4頭體重為 （25±3）kg的健康徐淮山羊，安裝永久性瘤胃瘺管，用以采集混合瘤胃液。單圈飼養(yǎng)，自由清潔飲水。粗飼料為鍘短的（3 cm）羊草，精料為玉米、豆粕、NaCl 0.5%、添加劑1%，參照NRC（1981）的山羊營(yíng)養(yǎng)需要推薦量，試驗(yàn)羊每日代謝能供給量為推薦量的1.2倍，每日08∶00 和 18∶00 等量飼喂。

1.2 體外發(fā)酵裝置 發(fā)酵裝置由恒溫振蕩水浴鍋和250 mL三孔（進(jìn)氣孔、出氣孔及采樣通道）的橡皮塞的錐形瓶組成。錐形瓶用橡皮塞塞好后，通二氧化碳并調(diào)節(jié)氣體流量，使其在39℃條件下培養(yǎng)。

1.3 人工唾液 按照Menke和Steingass（1988）的方法配制。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)采用單因子四水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.5 吞噬試驗(yàn)

1.5.1 試驗(yàn)分組 試驗(yàn)分為細(xì)菌組（180 mL培養(yǎng)體系）和原蟲(chóng)組（150 mL培養(yǎng)體系）。培養(yǎng)底物為精料（玉米：豆粕=65∶35）和粗飼料（羊草），其中細(xì)菌組1.8 g/瓶，原蟲(chóng)組1.5 g/瓶。處理仍按精粗比不同分為 A（1∶9）、B（3∶7）、C（5∶5）、D（7∶3）四個(gè)組，每組 3個(gè)重復(fù)。 標(biāo)記物為15N-（NH4）2SO4（由上?；ぱ芯吭嘿?gòu)買(mǎi)，豐度為99.14 atom%），添加量為 350 mg/L（細(xì)菌組）。

1.5.2 試驗(yàn)步驟 （1）采集混合瘤胃液，四層紗布過(guò)濾，與人工唾液鹽（事先通CO2至飽和，于39℃水浴30 min）2∶1的比例放入裝有培養(yǎng)底物（細(xì)菌組1.8 g/瓶；原蟲(chóng)組1.5 g/瓶）的錐形瓶，細(xì)菌組共180 mL，原蟲(chóng)組共150 mL，塞好橡皮塞，通過(guò)進(jìn)氣通道通入二氧化碳?xì)怏w，進(jìn)氣口于瓶底，調(diào)節(jié)氣體流速，39℃恒溫水浴振蕩 （125 r/min）培養(yǎng)6 h；（2）培養(yǎng)到6 h時(shí)，將細(xì)菌組培養(yǎng)液300目濾布過(guò)濾，200 g離心15 min，上清液轉(zhuǎn)入裝有相同培養(yǎng)底物并加有15N標(biāo)記物的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)繼續(xù)在原來(lái)的條件和環(huán)境下培養(yǎng)（標(biāo)記細(xì)菌）；（3）標(biāo)記1.5 h時(shí)從細(xì)菌組各取30 mL樣待測(cè)標(biāo)記率 （劉翔等，2010）及計(jì)數(shù)細(xì)菌。同時(shí)將原蟲(chóng)組200 g離心15 min，沉淀轉(zhuǎn)移至對(duì)應(yīng)的細(xì)菌組，進(jìn)行吞噬試驗(yàn)。（4）分別于 0、15、30、45、60 min 和 75 min 取 20 mL，立即加等量的甲醛溶液。之后200 g離心15 min無(wú)損失的轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，200 g離心15 min，棄上清，沉淀真空冷凍干燥 24 h；（5）將干燥后的沉淀準(zhǔn)確稱(chēng)重，記錄結(jié)果即為原蟲(chóng)產(chǎn)量，之后無(wú)損失的轉(zhuǎn)至凱氏消化管內(nèi)，消化2 h后全微量法凱氏定氮；（6）吸收液中加入0.1 mol/L的鹽酸幾滴，75℃下水浴濃縮至1～3 mL，上質(zhì)譜儀測(cè)定樣品中15N豐度。（7）吞噬末取樣1 mL，并與1 mL MFS混合，用于計(jì)數(shù)原蟲(chóng)。

1.6 瘤胃微生物的計(jì)數(shù)

1.6.1 原蟲(chóng) 以MFS染液（NaCl 8 g，甲基綠0.6 g，福爾馬林溶液100 mL，定容至1000 mL）染色，用血球計(jì)數(shù)板在光鏡下計(jì)數(shù)（100×，400×）。

式中N為計(jì)數(shù)的四個(gè)中方格的總數(shù)；D為稀釋倍數(shù)。

1.6.2 細(xì)菌 以結(jié)晶紫溶液染色和做倍比稀釋?zhuān)糜?jì)數(shù)板在油鏡下計(jì)數(shù)（×1000）。

式中N為計(jì)數(shù)方格的總數(shù)；S為計(jì)數(shù)方格數(shù)；D為稀釋倍數(shù)。

1.7 計(jì)算公式

式中△V為滴定時(shí)所用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；C為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液摩爾濃度，mol/L；0.014為氮的毫摩爾質(zhì)量。

15N 富 集 量=（微 生 物 產(chǎn) 量 ，mg）×（N%）×（15N%）；

細(xì)菌對(duì) （NH4）2SO4利用率=細(xì)菌中15N量／添加硫酸銨中15N量×100%；

細(xì)菌蛋白循環(huán)率=原蟲(chóng)吞噬細(xì)菌N量/細(xì)菌總N量×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行整理，運(yùn)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性采用LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同精粗比底物條件對(duì)瘤胃細(xì)菌15N標(biāo)記率的影響 見(jiàn)表1。

由表1可以看出：細(xì)菌產(chǎn)量以D組最高，B組與D組間差異不顯著，B、D兩組極顯著高于A、C組，而A組與C組間差異不顯著；A組和C組的細(xì)菌含氮量極顯著高于B、D組，而A組與C組間、B組與D組間差異均不顯著，其中以A組的細(xì)菌含氮量最高，達(dá)到9.32%，而B(niǎo)組僅為5.69%；細(xì)菌的15N豐度為B組與C組極顯著高于A組和D組，且B組與C組間、A組與D組間差異均不顯著，B組的15N豐度為四組中最高，15N豐度最小的是A組，為5 atom%；細(xì)菌15N富集量以B組最高，達(dá)到258.79 μg/30 mL，B組與D組間差異不顯著，而極顯著高于A、C兩組，D組與C組間差異不顯著，而極顯著高于A組，且A組與C組間差異不顯著；細(xì)菌對(duì)硫酸銨利用率以B組最高，達(dá)到11.72%，B組與D組間差異不顯著，而極顯著高于A、C兩組，D組與C組間差異不顯著，而極顯著高于A組，且A組與C組間差異不顯著，其中A組細(xì)菌對(duì)硫酸銨利用率最低，僅為4.91%；細(xì)菌15N標(biāo)記率以A組最高，其次為C組，D組的標(biāo)記率為四組中最低，僅達(dá)到53.86%。

表1 不同精粗比對(duì)瘤胃細(xì)菌15N標(biāo)記的影響

2.2 不同精粗比底物對(duì)瘤胃原蟲(chóng)吞噬細(xì)菌的吞噬量與吞噬N速率的影響 吞噬量與吞噬時(shí)間的線(xiàn)性關(guān)系是吞噬速率的計(jì)算的基礎(chǔ)，確定攝食試驗(yàn)的時(shí)間對(duì)保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性尤為重要。由于原蟲(chóng)的攝食特性受內(nèi)外因素影響較大，而目前對(duì)其攝食規(guī)律了解并不深入，因此每一次試驗(yàn)應(yīng)該以攝食預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果為參考。據(jù)本次試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果分析，綜合考慮后將原蟲(chóng)的吞噬速率計(jì)算時(shí)間定到75 min。如圖1所示，在75 min內(nèi)吞噬量線(xiàn)性上升，未達(dá)到平臺(tái)與下滑期；進(jìn)一步對(duì)75 min內(nèi)吞噬量與時(shí)間線(xiàn)性回歸分析，各組擬合方程的R值都在0.939之上，也反映了吞噬量與吞噬時(shí)間的良好線(xiàn)性關(guān)系，說(shuō)明在該時(shí)間段之內(nèi)吞噬試驗(yàn)結(jié)果的可靠性較高。因此針對(duì)本研究的具體情況攝食試驗(yàn)時(shí)間確定為75 min較為客觀可靠。

對(duì)原蟲(chóng)的吞噬量與時(shí)間進(jìn)行75 min內(nèi)線(xiàn)性回歸分析，回歸方程為：

式中：Y為原蟲(chóng)吞噬細(xì)菌N量（pg/cell），X為吞噬時(shí)間（min）。

圖1 不同精粗比底物下原蟲(chóng)吞噬量隨時(shí)間的變化

由回歸方程可以計(jì)算原蟲(chóng)的吞噬N速率，A、B、C、D 組分別為 25.27、29.69、23.17 pg/（cell·h）、和 35.11 pg/（cell·h）。

2.3 不同精粗比底物對(duì)瘤胃微生態(tài)的影響 見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，瘤胃原蟲(chóng)的密度以C組（5∶5）最高，極顯著高于其他三組，D組極顯著高于A、B兩組，而A組與B組差異不顯著，B組（1∶9）為四組中最低，僅為7.13×104cells/mL；在本試驗(yàn)設(shè)置的日糧條件下，原蟲(chóng)密度有隨著精粗比上升而上升的趨勢(shì)，但在精粗比最高的D組（7∶3）又有所下降。瘤胃細(xì)菌密度以 B 組（3∶7）最高，達(dá) 2.02×1010cells/mL，極顯著高于A、C兩組，而與D組差異不顯著，A 組（1∶9）細(xì)菌密度最低。

表2 飼料精粗比對(duì)瘤胃微生態(tài)的影響

A、B、C、D 四組吞噬 N 速率（見(jiàn)表 2）分別為：25.27、29.69、23.17 pg/（cell·h）和 35.11 pg/（cell·h）。四組間差異明顯，以D組最高，C組最低。

根據(jù)原蟲(chóng)的密度計(jì)算原蟲(chóng)對(duì)細(xì)菌的吞噬N量結(jié)果（表2）表明：以D組最高，為30.34×105pg/（mL·h）， 以下依次為 B 組 21.16×105pg/（mL·h），C 組 20.95×105pg/（mL·h），A 組最低，為 18.11×105pg/（mL·h），這與原蟲(chóng)吞噬 N的速率高低順序有所不同，造成的原因是由于作為吞噬者的原蟲(chóng)細(xì)胞密度不同所致。結(jié)合細(xì)菌的密度再計(jì)算由于原蟲(chóng)吞噬造成的細(xì)菌蛋白循環(huán)的周轉(zhuǎn)時(shí)間和周轉(zhuǎn)率，結(jié)果表明：以 B 組（3∶7）周轉(zhuǎn)率最低，為 1.94%（即每小時(shí)約有1.94%的細(xì)菌被原蟲(chóng)吞噬），周轉(zhuǎn)時(shí)間最長(zhǎng)為51.52 h（即因?yàn)樵x(chóng)吞噬經(jīng)過(guò)51.52 h細(xì)菌可周轉(zhuǎn)更新一輪）；以 C 組（5∶5）周轉(zhuǎn)率最高為2.79%，周轉(zhuǎn)時(shí)間最短為35.80 h；另外A組（1∶9）擁有較高的周轉(zhuǎn)率（2.52%）和較短的周轉(zhuǎn)時(shí)間（39.75 h），與細(xì)菌吞噬量最高的 D 組（7∶3）基本接近。

2.4 不同精粗比底物對(duì)瘤胃內(nèi)MCP微循環(huán)的影響 據(jù)所測(cè)定的各組的細(xì)胞密度，以4 L來(lái)估計(jì)山羊瘤胃內(nèi)容物（馮仰廉，2004），估測(cè) A、B、C 和D各組每天每頭山羊因原蟲(chóng)吞噬導(dǎo)致的細(xì)菌N循環(huán)量分別為：173.88、203.11、201.14、291.25 mg。以系數(shù)6.25轉(zhuǎn)換成各組菌體蛋白循環(huán)量也列于表2，其中D（7∶3）組每天每頭山羊MCP循環(huán)量最大，達(dá)到 1.82 g，接下來(lái)是 B 組（1.27 g）和 C 組（1.26 g），A 組（1∶9）最低，僅為 1.09 g。

3 討論

3.1 不同精粗比底物對(duì)15N標(biāo)記瘤胃細(xì)菌的影響 底物不同精粗比對(duì)細(xì)菌產(chǎn)量、細(xì)菌含氮量、瘤胃細(xì)菌15N富集量以及對(duì)硫酸銨的利用率均有顯著影響，從而造成15N標(biāo)記細(xì)菌的標(biāo)記率方面存在一定差異（劉翔等，2010）。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌產(chǎn)量以B組和D組較高，極顯著高于A、C兩組，這與表3中所體現(xiàn)的細(xì)菌密度具有一致性，由于在精粗比為3∶7和7∶3時(shí)細(xì)菌密度較高，所以在此處理下細(xì)菌的產(chǎn)量較大。這也是造成B組和D組瘤胃細(xì)菌15N富集量高于其他兩組的原因。而B(niǎo)組雖然具有最高的15N富集量和最高的硫酸銨利用率，但細(xì)菌標(biāo)記率卻只有67.49%，這是因?yàn)榱鑫讣?xì)菌中可以利用硫酸銨的種類(lèi)相對(duì)固定，雖然在精粗比為3∶7時(shí)細(xì)菌對(duì)硫酸銨的利用率很高，也使得15N在瘤胃細(xì)菌中的絕對(duì)含量達(dá)到最高，但由于B組細(xì)菌數(shù)量為四處理中最高，因此其相對(duì)比例并不高，即在精粗比為3∶7的條件下瘤胃細(xì)菌標(biāo)記率較低的原因。

3.2 不同精粗比底物對(duì)瘤胃微生物細(xì)胞密度的影響 原蟲(chóng)以吞噬和降解淀粉與多糖為主，但日糧中一定范圍比例的粗飼料有利于原蟲(chóng)的生長(zhǎng)，粗飼料的比例在40%～50%時(shí)原蟲(chóng)的密度最大，其種類(lèi)也最豐富；精料比例過(guò)高會(huì)導(dǎo)致瘤胃pH劇降，而使原蟲(chóng)群體減少甚至消失。本研究中原蟲(chóng)的密度以5∶5組最高，并有隨精粗比上升而上升的趨勢(shì)，與以上觀點(diǎn)有一定的一致性。但在精粗比最高的7∶3組原蟲(chóng)的密度又下降，這可能是由于精粗比進(jìn)一步上升導(dǎo)致了pH迅速下降，在一定程度上限制了原蟲(chóng)生長(zhǎng)所致。

精粗比不合理是影響MCP合成效率及動(dòng)物生產(chǎn)的重要因素之一。楊紅建和馮仰廉（2003）研究表明RSI發(fā)酵罐中72 h時(shí)微生物N的產(chǎn)量以培養(yǎng)底物的纖維素與淀粉比率最高時(shí)最小，回歸分析認(rèn)為在可利用N相同條件下，MCP合成效率取決于底物中結(jié)構(gòu)性和非結(jié)構(gòu)性碳水化合物比率。Firkins（1996）認(rèn)為，為了實(shí)現(xiàn)MCP的最大合成，反芻家畜日糧中應(yīng)含有適宜的谷物和脂肪比例。本試驗(yàn)結(jié)果也印證了日糧的組成是影響MCP合成的這一觀點(diǎn)；結(jié)果同時(shí)表明精粗比為1∶9組原蟲(chóng)和細(xì)菌的密度都較低，提示粗飼條件下不利于MCP合成。

微生態(tài)系統(tǒng)中的原蟲(chóng)與細(xì)菌之間在既定條件下是相互影響的。原蟲(chóng)對(duì)細(xì)菌的捕食可能導(dǎo)致細(xì)菌群體減少；而細(xì)菌的密度、生態(tài)位也反過(guò)來(lái)影響原蟲(chóng)對(duì)其的捕食，有些細(xì)菌甚至對(duì)原蟲(chóng)的捕食有抵御能力。因此，瘤胃微生態(tài)中細(xì)菌群體的減少可能是由于原蟲(chóng)對(duì)細(xì)菌的捕食而導(dǎo)致。Nhan等（2007）研究20 d試驗(yàn)期內(nèi)牛瘤胃微生物的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果表明，細(xì)菌密度有伴隨著原蟲(chóng)密度下降而提高的趨勢(shì)，并指出瘤胃原蟲(chóng)與細(xì)菌之間的互作關(guān)系基本上是已經(jīng)定論。本試驗(yàn)中細(xì)菌的密度C組小于B組，除了日糧的影響外，還可能與原蟲(chóng)密度從B組到C組變大，而導(dǎo)致對(duì)細(xì)菌的捕食增加有一定的關(guān)系。

3.3 不同精粗比底物對(duì)瘤胃原蟲(chóng)吞噬速率的影響 本試驗(yàn)中，徐淮山羊瘤胃原蟲(chóng)吞噬細(xì)菌N的速率為 23 ～ 30 pg/（cell·h），且通過(guò)計(jì)算得出的蛋白微循環(huán)量也與Coleman等（1979）估算的原蟲(chóng)每日可吞噬2.5～4.5 g細(xì)菌干物質(zhì)相近，表明本研究的可靠性。但原蟲(chóng)生長(zhǎng)環(huán)境的理化狀況（pH、NH3等）、原蟲(chóng)本身（種屬、生長(zhǎng)期、繁殖周期和細(xì)胞密度）、食物精粗比、細(xì)菌密度等諸多因素均影響原蟲(chóng)吞噬細(xì)菌速率（洪華生等，2001）。食物的影響則表現(xiàn)在當(dāng)細(xì)菌濃度低時(shí)，攝食速率與食物濃度成正比；當(dāng)食物濃度到了一定程度后食物濃度再提高攝食速率也不再增加。如當(dāng)細(xì)菌的濃度達(dá)到80～100 mg/L后，原蟲(chóng)的攝食速率不再增加；食物濃度繼續(xù)提高將導(dǎo)致其攝食、繁殖速率的下降（梁鵬等，2003）。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著精料添加量的增加，培養(yǎng)體系的pH值不斷下降，D組（7∶3）原蟲(chóng)密度極顯著低于C組（5∶5），原蟲(chóng)數(shù)目的減少說(shuō)明原蟲(chóng)的活性受到了抑制作用，進(jìn)而對(duì)原蟲(chóng)的種類(lèi)及其攝食活動(dòng)產(chǎn)生了影響。

前面也已經(jīng)提到，底物結(jié)構(gòu)的改變將通過(guò)影響瘤胃的理化狀況、原蟲(chóng)的種屬結(jié)構(gòu)而影響原蟲(chóng)對(duì)細(xì)菌的吞噬速率。在一定范圍內(nèi)增加多糖與淀粉的比例能提高原蟲(chóng)的活力和促進(jìn)原蟲(chóng)的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，在一定的精粗比范圍內(nèi)，瘤胃原蟲(chóng)數(shù)量有隨精料比例上升而上升的趨勢(shì)，且原蟲(chóng)吞噬細(xì)菌速率的結(jié)果也表現(xiàn)出比較大的差異，其中以 D 組（7∶3）最高，而 C 組（5∶5）為四處理中最低。其從 A 組（1∶9）到 B 組（3∶7）吞噬速率的上升可能是由于上述原因，即細(xì)菌濃度低時(shí)，攝食速率與食物濃度成正比所致；而由C組到D組原蟲(chóng)吞噬率升高的原因也與細(xì)菌密度有直接的關(guān)系，或者也可能因?yàn)樘囟ǖ娜占Z選擇了特定的原蟲(chóng)種屬，而不同種屬原蟲(chóng)其吞噬速率有所不同 （Simek等，1995）所致。由于瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)十分復(fù)雜，影響原蟲(chóng)吞噬速率的因素又較多，加之此領(lǐng)域研究中目前還沒(méi)有很多的文獻(xiàn)可以參考，因此以上研究結(jié)果或推斷需在進(jìn)一步的試驗(yàn)中加以驗(yàn)證。

3.4 不同精粗比底物對(duì)瘤胃微生態(tài)和微生物蛋白微循環(huán)的影響 若以通常報(bào)道的瘤胃原蟲(chóng)吞噬細(xì)菌的速率102～104cells/mL、 原蟲(chóng)105～106cells/mL、細(xì)菌109～1011cells/mL計(jì)，則由于原蟲(chóng)的吞噬約12 h可使得細(xì)菌更替一次。研究同時(shí)表明原蟲(chóng)不存在時(shí)細(xì)菌的更替率為0.3%～2.7%，而原蟲(chóng)存在時(shí)更替率增加為2.4%～3.7%。反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)的原蟲(chóng)無(wú)法利用氨合成自身蛋白，必須利用飼料和微生物中的蛋白質(zhì)作為其主要的氮源。盡管原蟲(chóng)具有部分降解蛋白質(zhì)的能力，但其降解速度很慢，細(xì)菌還是瘤胃中降解蛋白質(zhì)的主要微生物。細(xì)菌先將可溶性蛋白吸附在細(xì)胞表面或是吸附到不溶性蛋白質(zhì)上，再由其胞聯(lián)酶發(fā)揮降解作用。瘤胃細(xì)菌所分泌的蛋白分解酶為混合型，不同種類(lèi)細(xì)菌在蛋白降解中有互補(bǔ)特異性的協(xié)同效應(yīng)，而利于飼料蛋白質(zhì)的降解。

由于原蟲(chóng)對(duì)細(xì)菌和真菌的吞噬作用，會(huì)導(dǎo)致MCP的產(chǎn)量下降，增加宿主動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的維持需求，同時(shí)由于原蟲(chóng)在瘤胃內(nèi)的滯留時(shí)間較長(zhǎng)，且在反芻過(guò)程中與氧氣接觸的機(jī)會(huì)多，大部分原蟲(chóng)會(huì)因?yàn)樽匀芏劳?，因此原蟲(chóng)氮很少能夠進(jìn)入真胃和十二指腸為宿主所利用。反芻動(dòng)物日糧組成不同，導(dǎo)致發(fā)酵后瘤胃pH值變化不同，因此日糧結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是影響瘤胃原蟲(chóng)數(shù)量和種屬變化的主要因素。通常情況下，采食全粗飼料的奶牛瘤胃內(nèi)含 4×105～6×105個(gè)/mL內(nèi)容物，隨著日糧中精料的增加，日糧能量也隨之提高，動(dòng)物瘤胃內(nèi)的原蟲(chóng)數(shù)量也將隨之提高（Dehority等，1997）。當(dāng)日糧中粗飼料含量占到40%～50%時(shí)，瘤胃內(nèi)原蟲(chóng)數(shù)量最大，種類(lèi)也最豐富。

本試驗(yàn)中D組具有較高的原蟲(chóng)密度和最高的吞噬速率，因此其蛋白循環(huán)量最高，為1.82 g/（d·頭）。C組吞噬速率最低，但由于原蟲(chóng)密度最高而細(xì)菌密度很低，所以具有最高的循環(huán)率和最短的周轉(zhuǎn)時(shí)間。B組雖然吞噬速率相對(duì)較高，但由于原蟲(chóng)密度最小，而細(xì)菌密度最高，所以循環(huán)率最低，為1.94%，被更新一次的時(shí)間最長(zhǎng)，需51.52 h，計(jì)算得出，該組菌體蛋白循環(huán)量為1.27 g/（d·頭），僅為D組的69.78%，提示該底物組合能夠較好的減少微生物蛋白的循環(huán)量。值得注意的是A組，雖然吞噬量最低，菌體蛋白循環(huán)量也僅為1.09 g/（d·頭），但由于其細(xì)菌密度為四組中最小，所以細(xì)菌的循環(huán)率依然較高，為2.52%，并可在39.75 h內(nèi)被周轉(zhuǎn)更新一次。這提示：在粗飼條件下原蟲(chóng)的吞噬更容易影響微生物蛋白產(chǎn)量和宿主蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，而且研究也表明，在缺乏外源蛋白情況下原蟲(chóng)會(huì)迅速降解瘤胃內(nèi)源蛋白，并攝入和消化細(xì)菌蛋白（Wallace等，1997）。

4 結(jié)論

4.1 日糧精粗比顯著影響瘤胃微生物細(xì)胞的密度。原蟲(chóng)密度以C組（5∶5）最高，而細(xì)菌密度則以B 組（3∶7）最高，A 組（1∶9）原蟲(chóng)和細(xì)菌的密度均較低。

4.2 日糧精粗比顯著影響瘤胃原蟲(chóng)吞噬細(xì)菌N的速率及吞噬量。各組吞噬N量分別為：18.11×105、21.16 ×105、20.95 ×105、30.34 ×105pg/（mL·h），以A組最低。

4.3 日糧精粗比顯著影響山羊瘤胃內(nèi)菌體蛋白的微循環(huán)。每天每頭山羊因原蟲(chóng)的吞噬而帶來(lái)的菌體蛋白內(nèi)循環(huán)量各組分別為：1.09、1.27、1.26、

1.82 g，其中以 C 組（5∶5）循環(huán)率最大（2.79%），D組（7∶3）蛋白循環(huán)量最高，而 B 組（3∶7）循環(huán)率最低（1.94%），且蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)量?jī)H為 D 組（7∶3）的69.78%，可有效減少菌體蛋白循環(huán)量。

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