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        豬霉形體體外藥物敏感性試驗

        2010-06-22 03:22:12李曉云賈杏林
        湖南畜牧獸醫(yī) 2010年4期
        關(guān)鍵詞:土霉素蟲體形體

        李曉云,賈杏林

        (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,湖南 長沙 410128)

        豬霉形體(Mycoplasma suis,M.suis)是豬附紅細(xì)胞體病病原,其感染率極高,可導(dǎo)致貧血、黃疸、生長發(fā)育遲緩、免疫功能受損、對豬的其他呼吸道和腸道疾病的易感性增加。豬霉形體的感染會誘發(fā)很強的免疫反應(yīng),但對動物無明顯的保護(hù)作用,因此對發(fā)病動物的治療主要依賴藥物。已報道過的臨床用藥種類繁多,但是在已經(jīng)研究過藥物中未發(fā)現(xiàn)能持續(xù)清除豬霉形體的藥物,對首選治療藥物一直存在爭議,結(jié)果導(dǎo)致抗生素濫用,造成附紅體菌株耐藥性增加、動物性食品的藥物殘留等問題。本研究在李曉云等建立的豬霉形體體外無細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,通過直接觀察藥物作用效果、比較染蟲率、溶血率等的變化評價了強力霉素等8種抗生素對豬霉形體的殺滅作用,以期為高效安全藥物篩選、豬附紅細(xì)胞體病的防治等提供一定的依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 病原及紅細(xì)胞

        無菌靜脈采集疑似患附紅細(xì)胞體病豬血,檸檬酸三鈉抗凝,對采集的紅細(xì)胞涂片后進(jìn)行Giemsa染色鏡檢,參考Hoelzle等的方法進(jìn)行PCR鑒定。以上方法鑒定為豬霉形體陽性的血樣低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2 培養(yǎng)基和主要試劑

        試驗用培養(yǎng)液的配制參考文獻(xiàn)3。強力霉素、土霉素 (含量大于99%)、酒石酸泰樂菌素(1mg效價不少于800泰樂菌素單位),購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;氟苯尼考注射液,江蘇金牧王藥業(yè)有限公司;硫酸新霉素、慶大霉素、鏈霉素、青霉素為Amresco進(jìn)口分裝。將上述藥品用適宜的方法配制成相應(yīng)的濃度貯存液,過濾除菌,-20℃保存?zhèn)溆?,臨用前用培養(yǎng)液稀釋成相應(yīng)濃度的應(yīng)用液(見表 1),調(diào) pH至 7.4,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3 病原接種與培養(yǎng)

        參考李曉云等的方法將豬的染蟲紅細(xì)胞用含不同濃度藥物培養(yǎng)液替代PPLO-S-BS進(jìn)行培養(yǎng),每種藥物的每個濃度設(shè)3個重復(fù),每24h用含相應(yīng)藥物的培養(yǎng)液更換培養(yǎng)孔中1/2體積的上清部分培養(yǎng)液。

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        1.4 結(jié)果判定

        培養(yǎng)開始后觀察紅細(xì)胞和蟲體的變化,統(tǒng)計紅細(xì)胞M.suis染蟲率(PPE)、染蟲強度、蟲體顆粒大小、活力,染蟲率統(tǒng)計方法是于400倍倒置顯微鏡下,分別從3個不同的視野直接計數(shù)200個紅細(xì)胞,統(tǒng)計平均染蟲率,以紅細(xì)胞上觀察到1個以上的蟲體寄生即判為陽性。試驗結(jié)果用STATISTICA軟件進(jìn)行分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 藥物作用對豬紅細(xì)胞染蟲率、染蟲強度的影響

        藥物作用之前紅細(xì)胞染蟲率達(dá)86.7%,紅細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,呈棘球狀或鋸齒狀。加入藥物后,紅細(xì)胞染蟲率變化見表1。強力霉素(≥100μg/mL)、土霉素(≥1000μg/mL)作用后,PPE 與對照差異顯著(p<0.05);土霉素(≤100μg/mL)、各濃度的酒石酸泰樂菌素、氟苯尼考、新霉素、慶大霉素、鏈霉素、青霉素作用后M.suis PPE與空白對照差異不顯著。

        對染蟲強度的影響:藥物作用之前單個紅細(xì)胞可見的染蟲數(shù)量平均達(dá)5~10個以上,強力霉素、土霉素(≥100μg/mL)作用后紅細(xì)胞上可見蟲體的數(shù)量減少,平均只有0~3個,紅細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)圓形;其他幾種抗生素對豬霉形體染蟲強度無明顯影響。

        2.2 有效藥物對M.suis的殺滅作用

        上述明顯影響M.suis染蟲率的藥物作用于染蟲紅細(xì)胞后,蟲體首先從紅細(xì)胞上游離至培養(yǎng)液中,作升降、扭轉(zhuǎn)、翻滾、伸屈、搖擺、轉(zhuǎn)圈等多種形式的運動,后運動減弱,蟲體消失不見。紅細(xì)胞原有的振顫、擺動、小范圍滑行、滾轉(zhuǎn)等運動特點也隨蟲體數(shù)量的減少減弱直至靜止不動。

        3 討論

        由于M.suis的體外培養(yǎng)大量增殖難題尚未破解,用傳統(tǒng)的藥敏試驗方法檢測其對藥物的敏感性受到限制。本研究參考李曉云等建立的M.suis體外培養(yǎng)方法,將受試藥物加入培養(yǎng)體系中,可隨時于鏡下直接觀察蟲體及染蟲紅細(xì)胞的變化。這一方法與鄭海紅等、張守法等的方法相比,具有結(jié)果更直觀,統(tǒng)計更接近培養(yǎng)的自然狀態(tài)的優(yōu)點。

        對M.suis有明顯殺滅效果的強力霉素、土霉素等有效濃度較高,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于霉形體屬的有效藥物抑制濃度,臨床上也報道藥物難以消除感染M.suis動物的帶蟲狀態(tài),據(jù)此我們推測M.suis的抗藥能力比較強,這可能是臨床上難以消除M.suis的原因之一。

        部分藥物或某些藥物的低濃度作用后,PPE不降反升(差異不顯著),分析其原因,一方面是藥物對M.suis無抑制作用,另一方面培養(yǎng)過程中蟲體可能有少量的增殖或部轉(zhuǎn)移到未感染的紅細(xì)胞上。

        臨床上常用的青霉素、鏈霉素、氟苯尼考、新霉素、慶大霉素等抗生素,以及對大部分霉形體屬有抑制作用的泰樂菌素,在本試驗中即時使用較高濃度也未觀察到其對M.suis的殺滅作用,因此,臨床上發(fā)生附紅細(xì)胞體病后應(yīng)慎用抗生素。更多有效藥物的篩選有待進(jìn)一步研究。

        [1]Henry,S.C.Clinical observations on eperythrozoonosis[J].J.Am.Vet.Med.Assoc.1979,174:601~603.

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        [3]李曉云,賈杏林,石德時,等.豬附紅細(xì)胞體體外連續(xù)培養(yǎng)[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2008,39(8):1142~1146

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