徐金娥 楊曉菊 張 云 江秀麗 陳子江 (青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科,青島 266003)

不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(Unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA)是指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生3次或3次以上的自然流產(chǎn),排除解剖結(jié)構(gòu)、染色體、內(nèi)分泌、自身免疫功能異常以及生殖道感染等因素,發(fā)生率0.5%～1%。近年來將連續(xù)發(fā)生2次或2次以上的流產(chǎn)也稱為復(fù)發(fā)性流產(chǎn),其發(fā)生率為5%[1]。生殖免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn),約50%～60%的早期URSA的發(fā)生與免疫因素有關(guān)[2],尤其是與殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(Killer immunoglobulin-like re-ceptors,KIR)及人類白細(xì)胞抗原(Human leukocyte antigen,HLA)的關(guān)系已成為生殖免疫研究的熱點(diǎn)[3]。蛻膜自然殺傷細(xì)胞(Natural killer,NK)與絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞之間存在復(fù)雜的識別機(jī)制,母體KIR與胎兒HLA-C基因組成特異性信號傳導(dǎo)通路影響NK細(xì)胞的功能,在胚胎種植及妊娠維持過程中發(fā)揮重要作用[4]。為探討KIR、HLA-C基因與URSA易感性的關(guān)系,我們對蛻膜KIR基因、絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞HLA-C基因多態(tài)性進(jìn)行分析,探討免疫遺傳因素在URSA中的作用,為URSA的病因診斷和臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 病例組(URSA組)選擇2006年1月至2008年2月在山東省立醫(yī)院生殖中心就診的不明原因早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者38例,年齡32.34±7.22歲,孕周9.64±2.89周。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[5]。所有患者平素月經(jīng)規(guī)律,內(nèi)分泌化驗(yàn)正常,無TORCH病毒感染史,抗心磷脂抗體(ACA)、抗核抗體(ANA)、抗雙鏈DNA抗體(dsDNA)、抗精子抗體(AsAb)檢測陰性,經(jīng)陰道超聲、子宮輸卵管碘油造影及宮腔鏡檢查生殖系統(tǒng)解剖正常,ABO血型抗體檢測抗A-IgG、抗B-IgG滴度低于1∶64,夫婦雙方及胚胎染色體核型分析正常。符合上述條件者納入U(xiǎn)RSA組。

對照組選擇同期在計(jì)劃生育門診行人工流產(chǎn)術(shù)的正常早孕婦女35例,年齡30.23±6.16歲,孕周8.61±2.11周,超聲證實(shí)胚胎發(fā)育正常,平素月經(jīng)規(guī)律,無自然流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)史。URSA組與對照組的年齡、孕周均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究經(jīng)山東省立醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有對象均簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本保存 人工流產(chǎn)術(shù)時(shí)留取URSA患者和正常早孕婦女的蛻膜及絨毛組織,PBS緩沖液漂洗分裝,迅速投入-196℃液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)法檢測蛻膜組織KIR基因 抽提蛻膜組織基因組DNA,用乙醇沉淀,析出后溶入ddH2O中。序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)(sequence-specific primer polymerase chain reaction,PCR-SSP)檢測蛻膜組織KIR基因,反應(yīng)體系20 μ l,含 dNTP 終濃度 2 mmol/L,MgCl22 mmol/L,引物終濃度214.3 nmol/L。反應(yīng)條件:96℃1分鐘,96℃25秒,65℃45秒,72℃30秒,5個(gè)循環(huán);96℃25秒,60℃45秒,72℃30秒,21個(gè)循環(huán);96℃25秒,55℃1分鐘,72℃2分鐘,5個(gè)循環(huán);72℃10分鐘。以KIR框架基因3DL2、3DL3、2DL4為內(nèi)參照,不含DNA的PCR體系作陰性對照,所有樣本重復(fù)測定2次。3個(gè)框架基因陽性而引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均陰性視為該基因陰性。引物參照文獻(xiàn)[6]由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成,各KIR基因引物序列見表1,PCR產(chǎn)物電泳見圖1。

表1 各KIR基因引物序列及片段長度Tab.1 The primer sequencies of KIR genes

1.4 DNA測序法分析絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞HLA-C基因

抽提絨毛組織基因組DNA,用乙醇沉淀,析出后溶入ddH2O中,吸光度A260/A280比例在1.5～1.9,符合PCR反應(yīng)要求。PCR反應(yīng)體系 50 μ l,反應(yīng)條件:95℃5分鐘,95℃30秒,65℃30秒,72℃30秒,5個(gè)循環(huán);95℃30秒,60℃30秒,72℃30秒,30個(gè)循環(huán);72℃10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳,見圖2。剩余PCR產(chǎn)物純化后,采用美國ABI公司BigDye Terminator v3.1測序試劑盒,按照使用說明在ABI 3100-Avant測序儀上測序,見圖3。HLAC DNA引物序列參照文獻(xiàn)由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成,引物序列:Generic forward primer(DNA):5′-TATTGGGACCGGGAGACACA-3′;HLA-C group 1 reverse primer(DNA):5′-GCGGGCAGGGCGGCCGCAGGTTCCGCAAGC-3′;HLA-C group 2 reverse primer(DNA):5′-GCGGGCTGCGCAGTTTCCGCAGGT-3′。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 KIR、HLA-C基因檢出頻率=檢出個(gè)數(shù)/總數(shù),SPSS軟件15.0 Fisher精確概率法計(jì)算URSA組與對照組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 蛻膜組織KIR基因頻率 用PCR-SSP法進(jìn)行KIR基因分型,檢測了迄今發(fā)現(xiàn)的14種KIR基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)14種KIR基因在URSA組與對照組蛻膜組織中均以不同頻率表達(dá),其中KIR2DL1、KIR2DL4、KIR3DL2、KIR3DL3的基因頻率為100%;與對照組相比,URSA組蛻膜組織中KIR2DS1的基因頻率顯著升高(P=0.03),其它KIR基因位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。

2.2 絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞HLA-C1、C2基因頻率 兩組基因HLA-C1、HLA-C2在絨毛組織中呈不平衡表達(dá),以HLA-C1基因占明顯優(yōu)勢。URSA組HLA-C1的基因頻率為66.67%,對照組HLA-C1的基因頻率為81.03%,兩組相比差異無顯著性,P=0.657;URSA組HLA-C2的基因頻率為33.33%,對照組HLA-C2的基因頻率為19.07%,兩組相比差異有顯著性,P=0.007。結(jié)果見表3。

圖1 一例URSA患者KIR基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 KIR genes of one URSA patient

圖2 PCR電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR product

圖3 HLA-C基因序列Fig.3 HLA-C gene sequence

表2 蛻膜組織KIR基因頻率Tab.2 The frequencies of KIR genes in patients compared with control subjects

表3 URSA組與對照組HLA-C基因頻率Tab.3 The frequencies of HLA-C genes in patients compared with control subjects

3 討論

近代生殖免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn),50%～60%早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生可能與免疫因素有關(guān)[2]。胚胎帶有父方異體抗原成分,母體免疫系統(tǒng)對此進(jìn)行識別并產(chǎn)生免疫應(yīng)答,妊娠的成功有賴于母體對胚胎半同種抗原的“免疫耐受”。而正常妊娠的免疫耐受受到諸多因素的影響和制約,任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)障礙,都有可能導(dǎo)致妊娠失敗,發(fā)生流產(chǎn)。由于KIR、HLA均是多肽基因的產(chǎn)物,來自父方的胎兒HLA-C和母體子宮蛻膜NK細(xì)胞的KIR之間相互作用,共同參與人類的免疫反應(yīng)[7,8]。

3.1 蛻膜KIR基因多態(tài)性與URSA的相關(guān)性 NK細(xì)胞是母胎界面的一種重要免疫職能細(xì)胞,不僅具有直接的細(xì)胞毒素殺傷作用,而且在控制感染和腫瘤細(xì)胞因子方面起著至關(guān)重要的作用,除此之外,NK細(xì)胞的功能與激活性和抑制性信號之間的平衡密切相關(guān)[9]。NK細(xì)胞表面存在多種受體,其中研究最多的是KIR,KIR調(diào)節(jié)能力失衡可影響NK細(xì)胞的功能,在機(jī)體抗感染免疫、腫瘤免疫、移植免疫中發(fā)揮作用[7]。人KIR基因是一種跨膜糖蛋白,位于19號染色體的白細(xì)胞受體復(fù)合體內(nèi),具有多基因性和多態(tài)性。迄今發(fā)現(xiàn)有14個(gè)KIR基因和2個(gè)假基因,根據(jù)其胞外決定簇的數(shù)量分為 KIR1D、KIR2D、KIR3D;根據(jù)胞漿區(qū)長短和免疫受體酪氨酸抑制性基序的有無,功能上分為抑制性和活化性兩種。抑制性或活化性KIR通過與滋養(yǎng)細(xì)胞的HLA-I類分子結(jié)合來調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的功能,在母胎界面發(fā)揮重要作用。

Varla-Leftherioti等[10]用 PCR-SSP方法檢測了URSA婦女外周血的KIR基因,結(jié)果表明,URSA婦女外周血中3種抑制性KIR基因表達(dá)下調(diào),而2種激活性KIR基因表達(dá)無差異;URSA婦女抑制性KIR缺乏,不能抑制NK細(xì)胞的殺傷活性,導(dǎo)致流產(chǎn)[11]。Witt等[12]用相同方法檢測了URSA婦女外周血KIR基因的表達(dá),卻得出了不同的結(jié)論:與正常早孕婦女比較,URSA婦女的KIR基因表型無明顯差別。蛻膜NK細(xì)胞比全血NK細(xì)胞能更多的表達(dá)與HLA-C抗原特異性結(jié)合的KIR[13,14],為進(jìn)一步明確KIR與URSA的相關(guān)性,我們用PCR-SSP方法檢測了URSA與正常早孕婦女蛻膜組織的KIR基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)14個(gè)KIR基因在蛻膜組織中均以不同頻率表達(dá),URSA婦女KIR2DS1的基因頻率較正常早孕婦女明顯升高,KIR譜的平衡向活化性受體傾斜,這與本中心的研究結(jié)果一致[15,16]。提示URSA患者蛻膜活化性KIR基因頻率增加,母胎界面局部免疫抑制環(huán)境失調(diào),蛻膜面局部抑制信號減弱,活化信號增強(qiáng),可能破壞了母胎界面的免疫穩(wěn)定狀態(tài),使NK細(xì)胞功能異常而發(fā)生不利于妊娠的免疫反應(yīng),發(fā)生流產(chǎn),從基因水平解釋了KIR與URSA的相關(guān)性。

3.2 HLA-C基因多態(tài)性與URSA的相關(guān)性 HLA-C屬于經(jīng)典的HLA-Ⅰ類分子,廣泛分布于有核細(xì)胞表面,根據(jù)第77和80位氨基酸的不同,HLA-C分為兩組:第一組(HLA-C1),Ser77/Asn80,包括 HLA-Cw01、Cw03、Cw07、Cw08、Cw12,其 α重鏈上第 80 位的天冬氨酸是KIR2DL2/2DL3、KIR2DS2/2DS3的特異性識別位點(diǎn);第二組(HLA-C2),Asn77/Lys80,包括HLACw02、Cw04、Cw05、Cw06、Cw15,其 α重鏈上第 80 位的賴氨酸是KIR2DL1/2DS1的特異性識別位點(diǎn)。兩組HLA-C分別與不同的KIR結(jié)合傳遞活化性或抑制性信號,調(diào)控NK細(xì)胞的功能,導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生[17,18]。研究證實(shí)所有合體滋養(yǎng)層細(xì)胞都表達(dá)HLA-C抗原[19],HLA-C配體與KIR相互作用來調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵入和胎盤的形成,而URSA患者絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞HLA-C基因的研究卻報(bào)道甚少,絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞HLA-C基因是否與不明原因早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有關(guān),目前尚未明確。Varla-Leftherioti等[10,11]研究顯示胚胎HLA-C基因與KIR不匹配可能與自然流產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)。王珊等[15,16]對URSA夫婦進(jìn)行綜合研究發(fā)現(xiàn),URSA患者KIR2DS1基因頻率較對照組升高,活化性KIR基因數(shù)目明顯高于對照組,夫婦雙方HLA-C2等位基因減少,可能是不明原因早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)病原因。Hiby等[20]檢測了URSA夫婦雙方的HLA-C基因,結(jié)果顯示URSA患者夫婦雙方HLA-C2的基因頻率明顯高于對照組,從而間接推測胎兒的HLA-C2基因頻率亦應(yīng)高于對照組。由于滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)父母雙方的HLA-C,而對于每次妊娠,胚胎可能表達(dá)不同的HLA-C分子,因此直接研究滋養(yǎng)細(xì)胞的HLA-C分子可更直觀的分析其與URSA的相關(guān)性。由于HLA-C分子在細(xì)胞表面的表達(dá)水平很低,僅為HLA-A、HLA-B抗原量的20%,傳統(tǒng)血清學(xué)方法在檢測HLA-C方面有很大的局限性,故我們采用DNA分型和測序方法分析HLA-C基因多態(tài)性。我們對URSA病人與正常早孕婦女絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的HLA-C基因進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HLA-C1、HLA-C2基因在絨毛組織中呈不平衡表達(dá),以HLAC1基因占明顯優(yōu)勢。URSA組HLA-C1基因的頻率(66.67%)較對照組(81.03%)下降,但差異無顯著性;而URSA組HLA-C2基因的頻率(33.33%)明顯高于對照組(19.07%),兩組相比差異有顯著性。HLA-C2基因頻率升高,HLA-C1、HLA-C2基因失衡可能影響妊娠結(jié)局。Yawata等[21]研究表明,HLA-Ⅰ類配體可增加NK細(xì)胞表達(dá)KIR的頻率;Sharkey等[22]則發(fā)現(xiàn)蛻膜NK細(xì)胞表達(dá)的能識別HLA-C抗原的KIR位點(diǎn)大于血中的NK細(xì)胞,KIR可增加NK細(xì)胞識別母胎界面表達(dá)HLA-C抗原的滋養(yǎng)細(xì)胞的能力。由此可見,絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)的HLA-C基因可能與蛻膜NK細(xì)胞表達(dá)的KIR相互影響,相互協(xié)調(diào),共同參與妊娠的調(diào)節(jié)。由于基因組僅是遺傳信息的儲存體,需通過轉(zhuǎn)錄、翻譯成蛋白質(zhì),才能執(zhí)行功能,進(jìn)一步分析蛻膜組織KIR、絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞HLA-C基因的表達(dá)將有助于更好的了解KIR/HLA-C信號傳導(dǎo)通路在妊娠中的作用。隨著對KIR單元型以及KIR/HLA-Cw復(fù)合物等位基因特異性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)認(rèn)識的逐漸增加,可更好的理解妊娠中KIR/HLA-C同種異體識別的模型。

綜上所述,蛻膜NK細(xì)胞活化性KIR基因頻率增加,與絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的HLA-C2配體結(jié)合,使NK細(xì)胞功能異常發(fā)生不利于妊娠的免疫反應(yīng),可能是引起URSA發(fā)病的免疫遺傳學(xué)因素之一。進(jìn)一步分析KIR、HLA-C基因在mRNA、蛋白水平的表達(dá)有可能為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的免疫遺傳機(jī)制帶來新的思路。

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