朱 超 楊鳴琦 趙守中 (西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,楊陵 712100)

環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)屬烷化劑類,是一種有效的治療惡性腫瘤化療劑,又是一種免疫抑制劑,長期使用可導(dǎo)致機體免疫功能下降,這使其臨床應(yīng)用受到限制[1]。因此,尋找能夠減弱CTX免疫抑制作用、又不影響其化療作用的理想方法或藥物具有重要臨床意義。

豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物中的主要成分為苦馬豆素(Swainsonine,SW),是具有直接殺死腫瘤細胞和免疫調(diào)節(jié)雙向作用的新型抗腫瘤藥物[2],研究表明,豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物能夠很好地刺激荷瘤動物的T淋巴細胞,使其活性升高,從而促進機體T淋巴細胞識別腫瘤特異性抗原,達到殺死腫瘤細胞的作用[3]。最新研究發(fā)現(xiàn),豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物對小鼠骨髓抑制和心肌毒性具有保護作用[4,5],并且其主要成分SW對正常小鼠細胞免疫功能的影響進行了研究[6],但SW能否頡頏化療藥物的免疫抑制作用以及SW的有效治療劑量還未見報道,本試驗利用CTX構(gòu)建小鼠免疫抑制模型,研究豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物對CTX致免疫抑制小鼠免疫功能的影響,并探討其抗腫瘤作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 近交系昆明種小鼠50只,6～7周齡,體重(20±2)克,雌雄各半,購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心,合格證號SCXK(軍)2002-05。

1.1.2 試驗用藥的制備與配置 將豆類絲核菌菌種3.2871A(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物病理學(xué)實驗室提供)接種于滅菌查氏蛋白胨培養(yǎng)基中,26℃培養(yǎng)14～16天,挑出菌絲,抽濾去除發(fā)酵液中的不溶雜質(zhì),即為豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物原液,氣相色譜測其SW含量為980.85 mg/L,流通蒸汽滅菌45分鐘,用時分別濃縮或稀釋成苦馬豆素含量分別為8、16和32 mg/kg的3種溶液,流通蒸汽滅菌備用。

1.1.3 主要試劑及儀器 四甲基偶氮唑鹽(MTT)、植物血凝素P(PHA-P),均為Sigma公司產(chǎn)品;小牛血清,蘭州民海生物工程有限公司;RPMI1640培養(yǎng)液,Gibco公司產(chǎn)品;二甲基亞砜(DMSO),Amresco公司產(chǎn)品;注射用環(huán)磷酰胺,0.2 g/瓶,山西普德藥業(yè)有限公司,批號20080702;綿羊紅細胞(SRBC)懸液;補體(3只無特定病原豚鼠的新鮮血清1∶10稀釋);全自動酶標儀,Thermo公司產(chǎn)品,紫外分光光度儀,CO2培養(yǎng)箱等。其他試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.1.4 分組給藥與免疫抑制模型的制備 將50只小鼠隨機分為5組,每組10只,Ⅰ組正常對照組,Ⅱ組(CTX模型組),Ⅲ組(SW低劑量組),Ⅳ組(SW中劑量組),Ⅴ組(SW高劑量組),Ⅰ、Ⅱ組灌胃生理鹽水0.4 ml/只,每日1次,共 11次,Ⅲ 、Ⅳ、Ⅴ組分別灌胃濃度為 8、16、32 mg/kg 的 SW,每日 1次,共11次;第6天在灌胃2小時后,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組腹腔注射CTX 80 mg/kg,每日 1次,連續(xù)3次,制備CTX致小鼠免疫抑制模型。

1.2 方法

1.2.1 白細胞計數(shù)及免疫器官指數(shù)測定 末次給藥24小時后分別于眼眶靜脈叢取血20 μ l,吹入盛有0.38 ml白細胞稀釋液的試管中,搖勻,將蓋玻片放在白細胞計數(shù)板正中,充液,靜置2～3分鐘,計數(shù)白細胞。然后用頸椎脫臼法處死小鼠,摘取小鼠脾臟和胸腺,稱重后計算臟器指數(shù)(臟器重量/體重)。

1.2.2 腹腔巨噬細胞吞噬中性紅試驗 在無菌條件下,每只小鼠腹腔注射滅菌生理鹽水5 ml,輕輕按揉腹部2～3分鐘,抽回腹腔液。用不完全RPMI1640洗滌離心后。再用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)細胞濃度至 1×106ml-1,取 100 μ l于96孔板,另加完全 RPMI1640 100 μ l為空白調(diào)零孔,37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時,甩去培養(yǎng)基,貼壁細胞即為腹腔巨噬細胞單層,每孔加入0.1%中性紅生理鹽水100 μ l,繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘,棄上清液,用PBS液洗2次,每孔加入細胞溶解液(醋酸∶無水乙醇=1∶1)100 μ l,室溫下放置過夜。待細胞溶解后,用酶標儀在492 nm處測定OD值[7,8]。

1.2.3 脾臟淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗 采用噻唑藍(MTT)比色法[9],給藥結(jié)束后處死動物,無菌取脾,制備脾細胞懸液,用含10%小牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)細胞濃度至1×106ml,取100 μ l細胞懸液加入96 孔培養(yǎng)板 ,并加入 50 μ l PHA-P(終濃度5 μ g/ml),置37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 66小時,棄上清,加5 g/L MTT 10μ l/孔孵育4小時,每孔加DMSO 100 μ l,震蕩10分鐘,用酶標儀在492 nm處測定OD值。以各樣本的OD值代表淋巴細胞的轉(zhuǎn)化能力。

1.2.4 血清溶血素水平測定[10]用綿羊紅細胞(SRBC)為抗原,按上述方法分組及給藥,第7天各組小鼠腹腔注射5%SRBC懸液0.4 ml誘導(dǎo)初次免疫應(yīng)答,第11天末次給藥1小時后眼球取血,將血清稀釋100倍,取 1 ml稀釋血清,加入5%SRBC懸液0.5 ml及10%補體血清0.5 ml,37℃溫育10分鐘,0℃中止反應(yīng)。1 500 r/min離心,取上清液用紫外分光光度儀波長413 nm處測定,以O(shè)D值作為判定血清溶血素水平的指標。

1.2.5 免疫抑制小鼠NK細胞殺傷活性測定 采用MTT法檢測[11],靶細胞為L929細胞株,以下列公式計算:殺傷率(%)=(靶細胞OD值-實驗組OD值)/靶細胞OD值×100%。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件分析,結(jié)果以±s表示,采用方差分析,各組間用LSD法比較分析。

2 結(jié)果

2.1 對免疫抑制小鼠白細胞數(shù)及免疫器官重量的影響 由表1可見,與Ⅰ組相比較,Ⅱ組白細胞數(shù)有明顯的下降(P＜0.01),與Ⅱ組相比較,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組的白細胞數(shù)都有明顯的提高(P＜0.01或 P＜0.05),而Ⅳ組恢復(fù)效果較好,臟器指數(shù)雖有所降低,但無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。說明豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物具有改善免疫抑制小鼠造血功能的作用。2.2 對免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅的影響 由表2可看出,與Ⅰ組相比較,Ⅱ組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅能力極顯著低于Ⅰ組(P＜0.01)。與Ⅱ組相比較,Ⅲ、Ⅳ組OD492值均高于Ⅱ組(P＜0.05或P＜0.01),Ⅴ組與Ⅱ組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。說明豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物能夠顯著提高免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力。

表1 豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物對免疫功能抑制小鼠白細胞數(shù)量和免疫器官指數(shù)的影響(n=10,±s)Tab.1 Effects of the Secondary Metabolites of Rhizotonia leguminicola on WBC,thymus index,and spleen index of immunosuppressed mice(n=10, ±s)

表1 豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物對免疫功能抑制小鼠白細胞數(shù)量和免疫器官指數(shù)的影響(n=10,±s)Tab.1 Effects of the Secondary Metabolites of Rhizotonia leguminicola on WBC,thymus index,and spleen index of immunosuppressed mice(n=10, ±s)

Note:Compared with groupⅠ,1)means significant difference(P＜0.05),2)means very significant difference(P＜0.01);Compared with groupⅡ,3)means significant difference(P＜0.05),4)means very significant difference(P＜0.01).Following the same.

Groups Dose(mg/kg)WBC(109L-1)Thymus index(mg/g)Spleen index(mg/g)Ⅰ - 6.99±0.52 2.83±0.19 6.45±0.42Ⅱ - 3.05±0.202) 2.34±0.25 5.95±0.23Ⅲ 8 5.73±0.621)4)2.48±0.32 6.33±0.25Ⅳ 16 6.88±0.684) 2.46±0.20 6.40±0.44Ⅴ 32 5.68±0.561)4)2.49±0.33 6.30±0.38

表2 豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物對免疫功能抑制小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅的影響(n=10,±s)Tab.2 Effects of the SecondaryMetabolites of Rhizotonia leguminicola on the phagocytosis of peritoneal macrophages in immunosuppressed mice(n=10,±s)

表2 豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物對免疫功能抑制小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅的影響(n=10,±s)Tab.2 Effects of the SecondaryMetabolites of Rhizotonia leguminicola on the phagocytosis of peritoneal macrophages in immunosuppressed mice(n=10,±s)

Groups Dose(mg/kg)Phagocytosis of peritoneal macrophages(OD492)Ⅰ - 0.555±0.012Ⅱ - 0.369±0.0202)Ⅲ8 0.457±0.0181)3)Ⅳ 16 0.528±0.0124)Ⅴ 32 0.387±0.0082)

表3 豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物對免疫功能抑制小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響(n=10,±s)Tab.3 Effects of the Secondary Metabolites of Rhizotonia leguminicola on lymphocyte transformation of immunosuppressed mice(n=10,±s)

表3 豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物對免疫功能抑制小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響(n=10,±s)Tab.3 Effects of the Secondary Metabolites of Rhizotonia leguminicola on lymphocyte transformation of immunosuppressed mice(n=10,±s)

Groups Dose(mg/kg) Lymphocyte transformation test(OD492)Ⅰ0.568±0.036Ⅱ-0.366±0.0342)-Ⅲ0.403±0.0282)Ⅳ8 16 0.579±0.0244)Ⅴ32 0.455±0.0211)3)

2.3 對免疫抑制小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響 由表3可看出,與Ⅰ組相比,Ⅱ組小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化極顯著低于Ⅰ組(P＜0.01),說明環(huán)磷酰胺對小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化造成了抑制。Ⅳ組、Ⅴ組OD492值均高于Ⅱ組(P＜0.05或P＜0.01),且Ⅳ組效果最好。說明豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物能夠顯著提高免疫抑制小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化。

2.4 對免疫抑制小鼠血清溶血素水平影響 由表4可看出,與Ⅰ組相比,Ⅱ組小鼠血液中溶血素水平極顯著低于Ⅰ組(P＜0.01),說明環(huán)磷酰胺抑制了漿細胞分泌抗體的能力。Ⅲ、Ⅳ組均極顯著高于Ⅱ組(P＜0.01),且Ⅳ組效果最好,Ⅴ組顯著高于Ⅱ組(P＜0.05)。說明豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物能夠顯著改善免疫抑制小鼠體液免疫應(yīng)答功能。

表4 豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物對免疫功能抑制小鼠血清溶血素水平影響(n=10,±s)Tab.4 Effects of the Secondary Metabolites of Rhizotonia leguminicola on serumlevels of hemolysin in immunosuppressed mice(n=10,±s)

表4 豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物對免疫功能抑制小鼠血清溶血素水平影響(n=10,±s)Tab.4 Effects of the Secondary Metabolites of Rhizotonia leguminicola on serumlevels of hemolysin in immunosuppressed mice(n=10,±s)

Groups Dose(mg/kg) Serum levels of hemolysin(OD413)Ⅰ0.377±0.015Ⅱ-0.195±0.0352)-Ⅲ0.324±0.0224)Ⅳ16 0.353±0.0374)Ⅴ32 0.292±0.0411)3)8

表5 豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物對免疫功能抑制小鼠NK細胞殺傷活性影響(n=10,±s)Tab.5 Effects of the Secondary Metabolites of Rhizotonia leguminicola on killing activity of NK cells in immunosuppressed mice(n=10,±s)

表5 豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物對免疫功能抑制小鼠NK細胞殺傷活性影響(n=10,±s)Tab.5 Effects of the Secondary Metabolites of Rhizotonia leguminicola on killing activity of NK cells in immunosuppressed mice(n=10,±s)

Groups Dose(mg/kg) Killing rates(%)Ⅰ53.64±4.1Ⅱ-37.81±5.02)-Ⅲ8 41.40±6.62)Ⅳ16 46.72±3.01)4)Ⅴ32 39.17±4.22)

2.5 對免疫抑制小鼠NK細胞殺傷活性影響 由表5可看出,與Ⅰ組相比,Ⅱ組小鼠NK細胞殺傷率極顯著低于Ⅰ組(P＜0.01),說明環(huán)磷酰胺造成了小鼠NK細胞殺傷活性抑制。與Ⅱ組相比,Ⅳ組小鼠NK細胞殺傷率顯著高于Ⅱ組(P＜0.01),Ⅲ組和Ⅴ組,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。說明豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物能增強免疫抑制小鼠NK細胞殺傷活性。

3 討論

早前研究表明,豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物可作為免疫調(diào)節(jié)劑、腫瘤轉(zhuǎn)移及擴散抑制劑、抗病毒和細胞保護劑等藥物使用,還可以促進骨髓增殖,能有效逆轉(zhuǎn)致死性輻照或高劑量化療所造成的骨髓抑制及隨后發(fā)生的嗜中性白細胞減少癥,并初步證明對人的惡性腫瘤有治療作用,因此,豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物具有很重要的抗腫瘤藥物開發(fā)價值[12,13]。

在制備免疫抑制動物模型的過程中,CTX劑量過低,不僅不能對機體免疫功能起抑制作用,反而可能會有促進作用,而免疫細胞在免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)過程中都需要被充分激活,隨著給藥時間的延長可能其抑制作用的效果會較差,甚至?xí)箼C體的免疫力增強[14,15],因此CTX的合適給藥量和給藥時間是十分關(guān)鍵的。本研究采用臨床常用的抗腫瘤烷化劑CTX作為免疫抑制劑,經(jīng)腹腔注射CTX 80 mg/(kg·d),連續(xù)3天方法制造免疫抑制模型[11],結(jié)果顯示注射CTX后小鼠的各項免疫指標均明顯降低(P＜0.01),說明建模成功。

本實驗結(jié)果表明,經(jīng)豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物灌胃后,各組小鼠的外周血白細胞數(shù)顯著高于Ⅱ組(P＜0.01),Ⅳ組恢復(fù)較好;胸腺和脾臟是機體主要的免疫器官,免疫抑制劑可使其萎縮,而免疫增強劑可使其增重,因此免疫器官相對重量的變化在免疫評價中占有重要地位,從臟器指數(shù)的檢測來看,各組小鼠給予豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物后,脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均差異不顯著(P＞0.05)這與文獻[4]報道的一致。巨噬細胞的吞噬能力是衡量機體非特異性免疫功能的指標之一,它不僅能直接吞噬病原微生物及外來異物,還能釋放溶菌素,因而在免疫應(yīng)答中起重要作用。結(jié)果顯示,Ⅲ組和Ⅳ組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅的能力明顯增強,Ⅳ組基本恢復(fù)正常。脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化是衡量細胞免疫功能的指標之一,結(jié)果顯示,注射CTX后Ⅱ組的OD492極顯著低于Ⅰ組(P＜0.01),給予豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物后,Ⅳ組和Ⅴ組的脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化顯著增強(P＜0.05或P＜0.01),這與文獻[6]報道的應(yīng)用純品SW效果基本一致。血清中的溶血素是B細胞受到紅細胞刺激后產(chǎn)生的一種抗體,故可反映機體的體液免疫水平。本實驗結(jié)果顯示,注射CTX后Ⅱ組小鼠的溶血素水平顯著降低(P＜0.01),給予豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物后,Ⅲ組和Ⅳ組均顯著高于Ⅱ組,并且當實驗用藥劑量為16 mg/(kg·d)時,即第Ⅳ組,免疫抑制小鼠體液免疫功能恢復(fù)至接近正常水平,說明豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物中劑量[16 mg/(kg·d)]能增強免疫抑制小鼠的體液免疫功能。NK細胞是主要的固有免疫細胞,同時也是一類異質(zhì)多功能的殺傷淋巴細胞,無需抗原刺激即可對靶細胞產(chǎn)生直接的殺傷作用。因此,NK細胞殺傷活性高低直接影響機體的免疫功能[16]。NK細胞殺傷活性測定結(jié)果顯示,Ⅳ組與Ⅱ組相比差異極顯著(P＜0.01),Ⅲ組和Ⅴ組,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。說明豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物中劑量[16 mg/(kg·d)]能增強免疫抑制小鼠NK細胞殺傷活性。

以上實驗結(jié)果表明,豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物劑量為8、16 mg/(kg·d)均可提高免疫抑制小鼠的外周血白細胞數(shù),頡頏CTX所致的小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的降低,恢復(fù)免疫抑制小鼠血清溶血素水平、脾臟淋巴細胞轉(zhuǎn)化以及NK細胞殺傷活性,在各免疫指標中雖然Ⅴ組也發(fā)生了一定變化,但不如Ⅳ組效果好,這可能是豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物中的SW的含量過大造成的[17]。

綜上所述,豆類絲核菌次級代謝產(chǎn)物中劑量[16 mg/(kg·d)]對CTX致免疫抑制小鼠的免疫功能有一定的恢復(fù)和提高作用,這可能是其抗腫瘤的作用機制之一。

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