袁 麗, 葉 健, 姜成濤, 張豐收

(1.中國人民公安大學,北京 100038;2.中國政法大學證據(jù)科學教育部重點實驗室,北京 100088;3.公安部物證鑒定中心,北京 100038;4.江西省九江市公安局,九江 332000)

0 引言

檢驗特殊類型的親緣鑒定,常常需要檢測更多的短串聯(lián)重復序列(short tandem repeats,STR)遺傳標記。尋找適合中國人群的、具有高度法醫(yī)學應用價值的 STR基因座是法醫(yī)物證的研究熱點。本文選擇了 D7S3048,D10S2325和 GATA 198B05基因座,對遼寧鞍山岫巖滿族和廣州漢族兩個群體進行遺傳多態(tài)性調查,以了解這些基因座在這兩個群體的法醫(yī)學應用價值。

1 材料和方法

1.1 樣本及提取 DNA

隨機采取遼寧省鞍山岫巖滿族 202名以及廣東省廣州市漢族 233名無關健康個體血樣,每個供血個體追溯 3代以上家族史。岫巖滿族樣本以 EDTA抗凝血保存,廣州漢族樣本以棉簽血痕保存。Chelex-100提取法[1]提取樣本 DNA,利用 Invitrogen公司 Qubit 快速熒光定量系統(tǒng)定量。

1.2 STR基因座引物合成

GATA198B05基因座引物序列根據(jù) Genbank合成,D7S3048和 D10S2325基因座引物是利用 Primer 3軟件設計而成。引物由上海生工生物公司合成,D10S2325引物中前導鏈 5′端標記 6-FAM熒光染料;D7S3048前導鏈 5′端標記 HEX熒光染料;GATA198B05前導鏈 5′端標記 TAMRA熒光染料。

1.3 PCR擴增

PCR反應體系為 10μL,包含:5×緩沖液 2.0 μL(緩 沖 液,含 200 μmol/L dNTP、1.5 mmol/L MgCl2),5μmol/L引物 0.2μL～0.6μL,Taq DNA聚合酶 1U,DNA模板 1μL(0.5～-1.0 ng)以及去離子水。PCR反應在 ABI 9700擴增儀上進行,PCR熱循環(huán)參數(shù)均設為:95℃11m in,94℃1min、55℃1 m in、70℃1min 30個循環(huán),60℃延伸 60min,25℃保持。

1.4 擴增片段的電泳分離與檢測

采用 ABI 3130型基因分析儀進行毛細管電泳分離,應用 ABIGenemapperID 3.2軟件分析結果,等位基因暫時以片段大小標記。按照基因計數(shù)法計算等位基因頻率。

1.5 測序及等位基因命名

從等位基因片段大小來看,GATA198B05和D7S3048基因座是四核苷酸重復序列,D10S2325基因座是五核苷酸重復序列。每個基因座挑選兩個以上等位基因進行測序。按照國際法醫(yī)血液遺傳學會(International Society of Forensic Haemogenetics,ISFH)在 1994年[2]和 1997年[3]對等位基因提出的命名原則,對各等位基因按其重復單位重復次數(shù)進行命名。

1.6 遺傳數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析

利用 PowerStatsV12軟件[4]進行統(tǒng)計學分析,得出這 3個 STR基因座在岫巖滿族和廣州漢族多態(tài)性信息含量(PIC)、雜合度觀測值(Ho)、個體識別力(DP)、非父排除率(PE)和基因頻率。利用 GENEPOP(4.0)軟件[5]對兩個群體的 3個 STR基因座的基因型頻率分布進行 Hardy-Weinberg平衡檢驗。

2 結果

2.1 3個 STR基因座電泳情況

3個 STR基因座在兩個群體均獲得有效擴增,峰型高尖、stutter峰少且低,不影響等位基因正常分型;雜合子的兩個等位基因峰高平衡。電泳分型結果舉例見圖1。

圖1 3個 STR基因座擴增電泳檢測結果(由左至右為 D 10S2325、D 7S3048和 GATA 198B 05基因座)

2.2 3個 STR基因座等位基因命名

每個基因座有兩個以上的等位基因獲得成功測序,圖2為 D10S2325基因座部分測序圖譜。根據(jù)測序結果,按照重復單位的重復次數(shù)對等位基因進行命名,具體見表1。

圖2 D 10S2325基因座測序圖譜,從上至下分別為 208bp和 233bp,按(TCTTA)m核心序列重復次數(shù)命名原則進行命名,這些片段的等位基因命名為 7和12

2.3 群體遺傳學參數(shù)

D7S3048,D10S2325和 GATA198B05基因座在岫巖滿族人群中分別檢出等位基因 12、12和 10個,基因型 44、46和 41種;在廣州漢族人群中分別檢出等位基因 11、19和 12個,基因型 44、60和 47種。兩個群體基因型分布經檢驗,所有 P值 ＞0.05,符合 Hardy-Weinberg平衡?；蝾l率分布、雜合度、多態(tài)信息量、個人識別力和非父排除率等見表2。

表1 3個STR基因座的等位基因序列結構及其命名

表2 3個STR基因座在岫巖滿族和廣州漢族的等位基因頻率和遺傳學參數(shù)

3 討論

STR基因座的法醫(yī)學應用價值可以通過它在群體中的多態(tài)性信息含量、雜合度、個人識別能力、非父排除率和等位基因頻率分布等統(tǒng)計學參數(shù)進行評價。本研究表明,在岫巖滿族和廣州漢族群體中,D7S3048,D 10S2325和 GATA198B05基因座多態(tài)信息量最低為 0.810,雜合度最低為 0.790,非父排除率最低為 0.580,個人識別能力最低為 0.948,這 3個 STR屬于高識別率基因座[6]。D7S3048和 GATA 198B05基因座在兩個群體中有 10～12個等位基因,分布良好。D10S2325基因座在岫巖滿族檢出12個等位基因,而在廣州漢族群體中則檢出 ＞17的等位基因,因此在設計復合擴增體系時,如果包含D10S2325基因座,則應將其放在大片段的位置,以免引起基因座之間的混淆。這 3個 STR基因座為四或五核苷酸重復序列,stutter峰少,有利于等位基因的分型,適合于法醫(yī)學親子鑒定和個人識別,在岫巖滿族和廣州漢族人群具有很高的法醫(yī)學應用價值。

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[2] DNA recommendations—1994 report concerning further recommendations of the DNA Commission of the ISFH regarding PCR-based polymorphisms in STR(short tandem repeat)systems[J].Int J Leg Med,1994(107):159-160.

[3] BarW,Brinkmann B,Budowle B,Carracedo A,et al.DNA recommendations:Further report of the DNA Commission of the ISFH regarding the use of the short tandem repeat systems[J].Int JLeg Med,1997(110):175.

[4] Allan T.Tools for analysis of population statistics[EB/OL].Profiles in DNA,Promega,1999 Corporation.

[5] Rousset F.GENEPOP'007:a comp lete re-implementation of the GENEPOP software for Windows and Linux[J].Molecu lar Ecology Notes,2008,8(1):103-106.

[6] Gill P,Urquhart A,Millican E,etal.A new method of STR interpretation using inferential longic developmentof a crim inal intelligence database[J].Int J Leg Med,1996,109:14-22.