孔紅 金玥雯 肖冰 姬開達(dá) 朱鼎良 高平進(jìn),2 張怡

(1.上海市高血壓研究所,上海 200025;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院高血壓科,上海 200025)

C反應(yīng)蛋白(C reactive protein,CRP)是一種炎癥和組織損傷的標(biāo)志物。近年來(lái)眾多研究[1-2]證實(shí)CRP參與了心血管疾病的發(fā)生,同時(shí)它也可作為一個(gè)有預(yù)測(cè)價(jià)值的心血管危險(xiǎn)指標(biāo)。CRP水平受年齡、吸煙、體質(zhì)量指數(shù)等多種因素的影響。最近研究[3-4]顯示CRP的遺傳度在27%～40%,提示CRP基因的變異也可能會(huì)對(duì)CRP水平產(chǎn)生影響,其中CRP基因 rs1205、rs1130864、和 rs1800947多態(tài)已被較多研究[5-7]證實(shí)與CRP濃度有關(guān)。

高血壓病患者的血管壁一般都有炎性反應(yīng),已知這種炎性反應(yīng)參與了高血壓病的發(fā)生、發(fā)展,但CRP是否可作為高血壓病的危險(xiǎn)因子尚無(wú)定論,CRP基因變異與原發(fā)性高血壓病的相關(guān)性也鮮有報(bào)道。

本研究在原發(fā)性高血壓病患者和正常血壓者對(duì)照組進(jìn)行CRP基因3個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)rs1205、rs1130864、和 rs1800947 的基因分型、單倍型分析及超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)濃度的檢測(cè),以探討CRP基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象和分組 共1384名受試者,均來(lái)自中國(guó)上海地區(qū)。其中712名為原發(fā)性高血壓病患者(EH組),均為漢族,無(wú)親緣關(guān)系;對(duì)照組(NT組)為672名年齡和性別與EH組匹配的血壓正常者。高血壓定義為收縮壓(SBP)≥140 mmHg或舒張壓(DBP)≥90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa);排除繼發(fā)性高血壓病患者。NT組 SBP＜130 mmHg,DBP＜85 mmHg。測(cè)定所有對(duì)象的身高、體質(zhì)量、血清總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、三酰甘油(TG)及血尿素氮(BUN)。EH組中有554例檢測(cè)了hs-CRP。本研究步驟得到上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院倫理委員會(huì)認(rèn)可;受試者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 一般指標(biāo)及hs-CRP檢測(cè) 所有入選者均于清晨空腹采肘靜脈血,用全自動(dòng)生化分析儀(200FR;T oshiba)測(cè)定 TC 、HDL-C、TG 、BUN 。 依據(jù)Friedewald公式計(jì)算得出低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。采用高敏免疫比濁法檢測(cè) hs-CRP(R&D公司試劑盒)。

1.2.2 血壓測(cè)量 患者靜坐10min以上,以水銀柱血壓計(jì)按標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)右上肢肱動(dòng)脈血壓3次,取差值小于4 mmHg的2次血壓的平均值。

1.2.3 DNA提取 抽取外周靜脈血4mL,EDTA抗凝,紅細(xì)胞清洗液2mL洗滌、離心 3次,取沉淀物,再加白細(xì)胞裂解液2mL、蛋白酶K 18μg,37℃水浴4 h,加酚、氯仿、乙醇提取白細(xì)胞基因組。標(biāo)化DNA 濃度至5 ng?μL-1。

1.2.4 SNP選擇 選擇 rs1205,rs1130864及rs180094基因位點(diǎn),已經(jīng)有報(bào)道上述3個(gè)位點(diǎn)和心血管疾病的有關(guān)聯(lián),且其值和CRP濃度有關(guān)聯(lián)。所選擇的SNP的詳細(xì)信息列于表1。2min;95℃10min;92℃15 s,60℃1min,45個(gè)循環(huán);4℃保存。等位基因的區(qū)分應(yīng)用ABI7900高通量熒光定量PCR儀(Applied Biosystems,美國(guó))。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。每組分別進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn),P＞0.05則符合Hardy-Weinberg平衡。對(duì)照組與EH組的等位基因和基因型頻率比較采用在線的SHEsis軟件完成(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php);Haploview 4.1(www.broad.mit.edu/mpg/haploview)分析各位點(diǎn)的連鎖不平衡程度。多重檢驗(yàn)應(yīng)用錯(cuò)誤檢出率(FDR)方法進(jìn)行,FDR q值的閾值為0.20。采用SPSS12.0軟件t檢驗(yàn)分析組間表型差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料比較 與NT相比,EH組 BMI、SBP、DBP、血清 TG 和 BUN 較高,而 HDL-C較低(P＜0.05)。兩組年齡,性別,TC和低密度脂蛋白膽固醇(LDL)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t檢驗(yàn),均P＞0.05)(表2)。

表2 高血壓組與對(duì)照組基本資料比較()

表2 高血壓組與對(duì)照組基本資料比較()

注:BMI:體質(zhì)量指數(shù);SBP:收縮壓;DBP:舒張壓;TC:總膽固醇;TG:三酰甘油;BUN:尿素氮;HDL-C:高密度脂蛋白膽固醇;LDL-C:低密度脂蛋白膽固醇

指標(biāo) EH組(n=712)N T組(n=672) P值性別(男/女) 402/310 349/323 0.094年齡(歲) 54.8±11.6 54.6±6.3 0.588 BMI(kg/m2) 26.2±3.4 23.0±2.6 ＜0.0001 SBP(mmHg) 145.3±20.0 114.4±12.0 ＜0.0001 DBP(mmHg) 89.2±12.9 75.9±7.6 ＜0.0001 TC(mmol?L-1) 4.88±0.93 4.83±0.94 0.301 TG(mmol?L-1) 2.26±1.55 1.36±0.79 ＜0.0001 LDL-C(mmol? L-1) 3.18±0.91 3.15±0.86 0.646 HDL-C(mmo?L-1) 1.28±0.46 1.46±0.35 ＜0.0001

表1 3個(gè)入選的SNP的詳細(xì)描述

1.2.5 SNP檢測(cè)方法 采用TaqMan熒光探針定量PCR,由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司提供探針和引物。反應(yīng)體系總體積5μL,其中 TaqMan通用PCR反應(yīng)混合液(Master-Mix)2.4μL,探針 0.08μL,DNA 模板(5 ng?μL-1)2.5μL。反應(yīng)程序:50℃

2.2 單個(gè)SNP與EH的關(guān)系 兩組3個(gè)SNP的基因型分布和等位基因的頻率見(jiàn)表3。在EH組與對(duì)照組,3個(gè)SNP位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。

2.3 單倍型分析 rs1205 C/T,rs1130864 A/G這2個(gè)基因位點(diǎn)經(jīng)過(guò)連鎖不平衡分析,D'值＜0.85,進(jìn)行單倍型分析。結(jié)果顯示這2個(gè)SNP主要組成3種單倍型(表4),其中單倍型H1(C-A)在NT組頻率顯著高于EH組[優(yōu)勢(shì)比(OR)=0.617,95%可信區(qū)間(CI)0.429～0.887,P=0.009]。多重檢驗(yàn)經(jīng)過(guò)FDR校正后,相關(guān)性仍然顯著(FDR q≤0.20)。

表3 兩組3個(gè)SNP位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率

表4 EH組和NT組單倍型的分布

2.4 EH組單倍型和表型的關(guān)系 在EH組中比較CA單倍型和其他單倍型的各種表型,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)(表5)

表5 EH組CA單倍型和其他單倍型的表型比較()

表5 EH組CA單倍型和其他單倍型的表型比較()

注:BMI:體質(zhì)量指數(shù);SBP:收縮壓;DBP:舒張壓;TC:總膽固醇;TG:三酰甘油;LDL-C:低密度脂蛋白膽固醇;hs-CRP:超敏C反應(yīng)蛋白

指標(biāo) CA單倍型(n=55)其他單倍型(n=499) P值性別(男/女) 33/22 315/184 0.046年齡(歲) 61.72±9.57 58.40±11.95 0.649 BMI(kg/m2) 26.18±3.82 26.10±3.25 0.871 SBP(mm Hg) 148.27±24.21145.93±19.46 0.410 DBP(mm Hg) 86.27±14.95 88.56±13.34 0.235 TC(mmol?L-1) 5.11±0.92 4.92±0.90 0.146 TG(mmol? L-1) 1.93±1.08 2.27±1.65 0.133 LDL-C(mmol?L-1) 3.01±0.67 2.81±0.72 0.056 hs-CRP(mg?L-1) 1.13±1.25 1.25±1.72 0.618

3 討 論

CRP于1930年被發(fā)現(xiàn)并命名[8],隨后被證實(shí)為炎癥的一種非特異但敏感的指標(biāo),在急性和慢性炎癥中均參與作用。高血壓病與動(dòng)脈粥樣硬化有著相似的動(dòng)脈炎性病理改變,國(guó)內(nèi)臨床研究[9]提示CRP與血管內(nèi)皮功能不全相關(guān)。2001年Bautista等[10]在對(duì)30例高血壓病與CRP關(guān)系的橫斷面研究中發(fā)現(xiàn),除外其他傳統(tǒng)高血壓病危險(xiǎn)因素影響后,CRP水平與EH仍密切相關(guān),并首次明確提出血清h多研究提示CRP濃度與高血壓病發(fā)生有關(guān)[11-12],hs-CRP在高血壓病多種危險(xiǎn)因素中具有較高的敏感性與特異性[13]。

國(guó)外許多研究[5-7,14-17]報(bào)道CRP的rs1130864、rs1205、和rs1800947單個(gè)SNP或單倍型與CRP水平相關(guān),但與冠心病的相關(guān)性尚有爭(zhēng)議[15-16],與高血壓病的相關(guān)性研究更少見(jiàn)報(bào)道。Komurcu-Bayrak等[18]對(duì)1138例土耳其人的研究發(fā)現(xiàn),rs3091244、rs1800947、rs1130864、rs1205在女性均與 CRP水平相關(guān),而在男性中 rs3091244和 rs1130864與CRP水平相關(guān);4個(gè)SNP組成的單倍型CGCA和TGTG分別與女性和男性CRP水平及高血壓病相關(guān)。Schumacher等[19]研究發(fā)現(xiàn)rs1130864、rs1800947和rs1205與健康人的CRP水平相關(guān),但與反映動(dòng)脈硬化的指標(biāo)——脈搏波速度(PWV)無(wú)關(guān)。rs1800947及與 rs13411665和rs1130864組成的單倍型CCC在日本人群中與缺血性腦卒中相關(guān)[20]。本研究未發(fā)現(xiàn)CRP基因rs1205、rs1800947和rs1130864單個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率及等位基因頻率在原發(fā)性高血壓與正常血壓對(duì)照組之間存在差異,但單倍型分析顯示CA單倍型在高血壓組和正常血壓對(duì)照組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示多位點(diǎn)的協(xié)同作用可能與高血壓病的發(fā)生關(guān)聯(lián)。高血壓病的發(fā)生、發(fā)展就是一個(gè)多基因的參與的復(fù)雜過(guò)程,單一的基因位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)原發(fā)性高血壓的易感性未足以顯示。本研究未觀察到單倍型與hs-CRP的相關(guān)性,可能與研究位點(diǎn)較少、單倍型CA在人群中的分布較低、例數(shù)較少有關(guān)。同時(shí)CRP濃度與年齡、性別、吸煙、肥胖、糖尿病、生理活動(dòng)和其他炎性因子有關(guān),本研究尚未能排除肥胖、血糖、血脂等代謝因素對(duì)CRP的影響。

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