曲友直 趙燕玲 李 敏 高國棟

血腦屏障(Blood-brain barrier,BBB)的破壞可導致血管源性腦水腫,是腦缺血再灌注損傷后腦水腫的重要病理基礎[1,2]。毛細血管內皮細胞之間的緊密連接是BBB結構和功能的基礎[3],咬合蛋白Occludin是內皮細胞之間緊密連接的重要結構蛋白,其水平的高低與BBB的開放、關閉關系密切。黃芪甲苷是中藥黃芪的主要活性成分,常作為黃芪及含黃芪(君藥)的中成藥定性定量評價的指標[4,5]。已有研究表明黃芪甲苷具有減少腦缺血再灌注后腦組織白細胞浸潤、抗炎性反應、減輕腦水腫等作用,但目前作用機制尚不明確。本研究通過觀察黃芪甲苷對大鼠腦缺血再灌注后腦組織含水量、伊文氏藍(Evans Blue,EB)含量及咬合蛋白occludin表達的影響,以探討其對BBB的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 黃芪甲苷(中國藥品生物制品檢定所,批號：110781-200613)。伊文氏藍購自美國Sigma公司。Occludin蛋白免疫組化試劑盒購自美國Zymed公司。醫(yī)學圖像分析系統(tǒng),型號 Olym pus BX-51。健康成年雄性SD大鼠,體重250～300 g,購自本校實驗動物中心。

1.2 檢測方法 72只SD大鼠隨機等分為4組,每組18只。A組為假手術組,栓線僅插入頸總動脈6 mm,不阻塞大腦中動脈,其余步驟同B組;B組為生理鹽水對照組,參照Zea Longa報道的方法[6],采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。結扎大鼠頸總和頸外動脈,自頸總動脈分叉處向頸內動脈插入栓線約(18.5±0.5)mm,阻斷大腦中動脈血流,造成局灶性腦缺血,大腦中動脈閉塞即刻經腹腔注射等體積生理鹽水;術后將栓線尾部置于皮下,缺血1.5 h后輕拔栓線造成血流再灌注24 h;C組為小劑量黃芪甲苷治療組,大腦中動脈閉塞即刻經腹腔注射黃芪甲苷10 mg/kg;D組為大劑量黃芪甲苷治療組,大腦中動脈閉塞即刻經腹腔注射黃芪甲苷20 mg/kg。再灌注24 h后每組隨機取6只大鼠斷頭取腦稱濕重,放入烤箱內干燥24 h后稱干。腦組織含水量按以下公式級算：腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重。每組中另外6只大鼠于處死前1 h經股靜脈緩慢注入2.5%伊文氏藍生理鹽水0.2 m l/100 g。再灌注24 h時開胸經左心室灌注生理鹽水,斷頭取腦稱重后放入甲酰胺中浸泡,收集浸泡的甲酰胺溶液,用分光光度計(620～680 nm)測得其吸光度,計算腦組織中EB含量。每組其余6只大鼠,在術后相應的時間點水合氯醛深度麻醉后,自左心室灌注生理鹽水200 m l沖凈血液,500 m l4%多聚甲醛溶液固定大鼠各組織,斷頭取腦;將標本在4%多聚甲醛溶液中后固定24 h;鼠腦自額極至枕葉分為A、B、C、D、E 5等份,取 C 腦片在恒溫冰凍切片機上做厚度為15μm的冠狀面位切片,進行免疫組化染色。免疫組化染色用圖像分析系統(tǒng)采集照片,在400倍視野下每張切片在梗死灶周圍隨機選取10個視野,計數免疫組化陽性血管。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS16.0軟件包。各組實驗值均以±s來表示,組間差異采用方差分析,同組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結 果

與A組相比,B組大鼠腦組織含水量、伊文氏藍含量明顯增多,occludin蛋白免疫組化陽性血管的數目顯著減少(P＜0.01);與B組相比,C組和D組大鼠腦組織含水量、伊文氏藍含量顯著減少,occludin蛋白免疫組化陽性血管的數目顯著增加(P＜0.05)。C組和D組比較,腦組織含水量、伊文氏藍含量及occludin蛋白免疫組化陽性血管的數目無顯著差異(P＞0.05)(表1)

表1 黃芪甲苷對大鼠腦缺血再灌注后腦組織含水量、伊文氏藍含量及occludin蛋白表達的影響

3 討 論

腦水腫是腦缺血再灌注損傷的基本病理變化之一,也是導致病情加重、甚至引起患者死亡的常見病因。血腦屏障的破壞可導致血管源性腦水腫,是腦缺血再灌注損傷后腦水腫的重要病理基礎[1,2]。細胞間緊密連接是一組復雜蛋白質構成的復合體。咬合蛋白(occludin)是細胞間緊密連接復合體的重要結構蛋白。咬合蛋白作為一種跨膜蛋白,其氨基端和羥基端位于細胞內,兩個環(huán)形結構位于細胞外,這兩個向細胞外伸出的環(huán)形結構與臨近細胞膜上occludin伸出的環(huán)形結構緊密相連,進而封閉彼此間細胞間隙。其胞內的氨基端和羥基端與膜相關鳥苷激酶樣閉鎖小帶蛋白(zonula occludens protein,ZO-1)緊密連接,再通過ZO-1與細胞骨架連接在一起,在細胞膜上得到固定并保持其連續(xù)性[7]。

本實驗結果表明,大、小劑量黃芪甲苷均可降低腦缺血再灌注后腦組織含水量及伊文氏藍含量。正常情況下伊文氏藍進入體內后與血清白蛋白結合不能通過BBB,腦缺血再灌注后由于BBB破壞、通透性增加。伊文氏藍會通過血管壁進入腦組織,因此伊文氏藍可作為示蹤劑對BBB破壞進行定量評價[8]。本研究結果顯示,大鼠腦缺血再灌注模型建立后腦內含水量及伊文氏藍含量顯著增加,表明在缺血再灌注損傷中血腦屏障結構遭到破壞,通透性顯著提高;使用黃芪甲苷治療后腦組織內含水量以及伊文氏藍含量明顯降低,提示黃芪甲苷能夠減輕缺血、缺氧造成的BBB通透性改變,減少蛋白漏出,一定程度上降低了腦細胞的水腫程度,遏制腦缺血病程的發(fā)展,從而發(fā)揮對腦缺血的保護作用。

本實驗結果還表明,大、小劑量黃芪甲苷均可上調腦缺血再灌注后occludin蛋白的表達水平。腦缺血再灌注后毛細血管內皮細胞occludin表達顯著降低,使內皮細胞間不能形成緊密連接復合體,進而導致BBB緊密連接的破壞和血管源性腦水腫的產生[9]。應用黃芪甲苷治療后表達降低的occludin顯著上調,提示黃芪甲苷可通過減少腦缺血再灌注后occludin蛋白的損失,維持緊密連接復合體結構的完整性,進而起到了保護血腦屏障的作用,這可能是黃芪甲苷發(fā)揮對腦缺血再灌注后血腦屏障保護作用的機制之一。

本研究結果還發(fā)現,大劑量黃芪甲苷治療組與小劑量黃芪甲苷治療組相比較,缺血再灌注后腦組織含水量、伊文氏藍含量及occludin蛋白的表達無顯著差異,說明黃芪甲苷對BBB的保護作用在一定范圍內與劑量大小無明顯關系,機制尚不清楚,本研究推測這可能與腦缺血再灌注 后血腦屏障破壞與多因素調控有關。

1 Nordal RA,W ong CS.Molecular targets in radiation-induced blood-brain barrier disruption.Int J Radiat Oncol Biol Phys,2005,62(1)：279-287.

2 Begley DJ,Brightman MW.Stru ctural and function aspects of the blood-brain barrier.Prog Drug Res,2003,61(1)：39-78.

3 Ge S,Song L,Rachter JS.Where is the blood-brain barrier really?JNeurosci Res,2005,79(4)：421-427.

4 胡芳弟,封士蘭,趙鍵雄,等.HPLC法測定黃芪中黃酮類成分和黃芪甲苷的含量.分析測試技術與儀器,2003,9(3)：175-177.

5 秦海林,趙天增,高令潔,等.人參皂苷與黃芪甲苷的薄層色譜分析.中國中藥雜志,1995,20(4)：226-227.

6 Longa EZ,W einstein PR,Carlson S,et al.Reversib le m iddle cereb ral artery occ lusion w ithou t caniectomy in rats.Stroke,1989,20(1)：84-91.

7 Matter K,Balda MS.Functional analy sis of tight junctions.Methods,2003,30(3)：228-234.

8 Ikede Y,W ang M,Nakazaw a S.Sim ple quantitative evaluation of blood brain barrier disrup tion in vasogenic b rain edema.Acta Neu rochir,1994,60(suppl)：119-120.

9 Mark KS,Davis TP.Cereb ralm icrovascular changes in permeability and tight junctions induced by hypoxia-reoxygenation.Am JPhysiol H eart Cire Physiol,2002,282(6)：H 1485-H 1494.