邢變枝 陳 暉 張?zhí)K明

在缺血性腦卒中的治療中恢復(fù)梗死區(qū)的血液供應(yīng)往往加重組織細(xì)胞功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞,即再灌注損傷,尋找有效的細(xì)胞保護(hù)方法是臨床上急待解決的問題。缺血后處理是指在缺血發(fā)生后長時(shí)間的再灌注之前對(duì)臟器進(jìn)行數(shù)次短暫的再灌注/缺血循環(huán)的處理方法。與缺血預(yù)處理一樣,缺血后處理能夠減輕再灌注后臟器損傷[1～3],近年發(fā)現(xiàn)HSP70也可對(duì)腦缺血再灌注損傷發(fā)揮重要的保護(hù)作用[4～6],但HSP70是否參與了缺血后處理誘導(dǎo)的保護(hù)機(jī)制有待進(jìn)一步證實(shí)。本研究先前工作證實(shí)缺血后處理可以減輕腦的再灌注損傷[7,8],但其具體機(jī)制目前少見報(bào)道。本研究觀察缺血后處理對(duì)皮質(zhì)內(nèi)HSP70表達(dá)的影響,探討腦缺血后處理可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑 HSP70、β-actin單克隆抗體購自Senta cruz公司。引物由上海英俊生物有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 8周齡雄性SD大鼠45只,體重250～280 g,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham)、缺血再灌注組(I/R)、缺血后處理組(Postcond),每組各15只。

1.3 模型建立 大鼠均采用Koizumi等線栓法經(jīng)右側(cè)頸外一頸內(nèi)動(dòng)脈插線建立右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞(m iddle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型[9]。栓線采用4-0尼龍單線,以10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉,仰臥固定,分離并暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery,CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery,ICA)和頸外動(dòng)脈(external carotid artery,ECA),結(jié)扎并切斷ECA及其分支,沿根部結(jié)扎ICA顱外分支翼腭動(dòng)脈;由ECA殘端插入一根尼龍單線,沿 ECA、CCA分叉部和ICA輕輕推進(jìn),至ICA顱內(nèi)分叉處時(shí)可阻斷流入MCA的血流,進(jìn)線長度18～20 mm;缺血時(shí)間為60 min,隨后抽出插線使血流恢復(fù)實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組除不插線外,余步驟同上。缺血后處理組在MCAO 60min后將尼龍線拔出5mm,再灌30s后再將尼龍線放入初始位置,缺血30 s,反復(fù)6次[7,8]。

1.4 標(biāo)本采集和處理 于再灌注24 h后一部分大鼠斷頭留取腦組織,速置液氮中保存待測,另一部分大鼠用4℃的40 g/L中性多聚甲醛灌流固定,斷頭取腦,于視交叉后1mm沿冠狀位切片,制備石蠟切片。

1.5 免疫組化檢測HSP70的表達(dá)水平 將石蠟切片再以新鮮配制的體積分?jǐn)?shù)為3%的H2 O2滅活細(xì)胞內(nèi)源性過氧化物酶,然后用血清封閉,根據(jù)測試指標(biāo)分別滴加抗HSP70單克隆抗體(1∶500稀釋)以及相應(yīng)生物素化二抗,DAB顯色,封片。應(yīng)用同濟(jì)千屏HPIAS2000型圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組織化學(xué)染色涂片進(jìn)行分析。

1.6 Western blot檢測腦皮質(zhì)中HSP70蛋白含量

取液氮保存的右腦皮質(zhì)組織,參照Matsumori等方法提取蛋白[10]。蛋白用考馬斯亮藍(lán)法定量,100℃加熱5 min,取40μg/lane上樣行電泳,樣本用15%Tris-Glycine膠電泳分離蛋白后,電轉(zhuǎn)到硝基纖維膜上,5%的脫脂牛奶封閉2 h,以1×TBST洗滌后與HSP70單克隆抗體(1∶500)4℃過夜,1×TBST洗滌后HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗(1∶2000),室溫孵育1 h,TBST洗滌后混合等體積的試劑盒(Senta cruz)A液和B液,與硝基纖維膜共孵育1min,與X光片曝光1 h,顯影、定影。用同樣方法標(biāo)記鼠單克隆抗體βactin作為胞漿蛋白內(nèi)參照。

1.7 RT-PCR檢測腦皮質(zhì)中HSP70m RNA表達(dá)水平

取液氮保存的右腦皮質(zhì)組織,采用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。大鼠HSP70正義和反義引物分別為5'-GGGTTTGGGTACTTTGGTTA-3',5'-CCCATAAGTTGGGAAACAGT-3',擴(kuò)增產(chǎn)物為317 bp;以β-actinmRNA 為內(nèi)參照,其正義和反義引物為5'-TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGT-3',5'-CCTAGAAGCATTTGCGGTGCACGATG-3',其產(chǎn)物為 285 bp。PCR條件為94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,擴(kuò)增35個(gè)循環(huán);最后一次為72℃延伸7min。取5 ul產(chǎn)物在含GOLDV IEW 的瓊脂糖凝膠上(2%)電泳,用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析,結(jié)果以目的基因β-actin比值表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,應(yīng)用SPSS軟件(11.5版),采用方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

HSP70主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)。假手術(shù)組腦皮質(zhì)組織神經(jīng)細(xì)胞HSP70表達(dá)不明顯或不表達(dá)(圖1),缺血再灌注組和缺血后處理組缺血區(qū)腦皮質(zhì)組織神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)較高,但是缺血后處理組腦皮質(zhì)組織神經(jīng)細(xì)胞HSP70表達(dá)顯著高于缺血再灌注組(圖1)。

圖1 各組HSP70免疫組化染色(×400)倍

Western blot檢測顯示：假手術(shù)組無明顯HSP70表達(dá),蛋白條帶僅有清淡顯影。缺血再灌注損傷24 h后,缺血再灌注組缺血再灌注區(qū)皮質(zhì)內(nèi)HSP70合成增加,缺血后處理組缺血再灌注區(qū)皮質(zhì)內(nèi)HSP70的合成較缺血再灌注組明顯增多(P＜0.05)(圖2)。β-actin作為胞漿成分加等量蛋白的質(zhì)控。

圖2 Western b lot檢測腦皮質(zhì)組織中HSP70表達(dá)變化 與假手術(shù)組比較,*P＜0.05;與缺血再灌注組比較,#P＜0.05

RT-PCR檢測顯示假手術(shù)組大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)有微量的HSP70m RNA表達(dá),缺血再灌注損傷24 h后缺血再灌注組缺血再灌注區(qū)大腦皮質(zhì)內(nèi)HSP70 mRNA表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05),應(yīng)用缺血后處理后缺血再灌注區(qū)大腦皮質(zhì)內(nèi)HSP70m RNA表達(dá)明顯增強(qiáng),顯著高于假手術(shù)組和缺血再灌注組(P＜0.05)(圖 3)。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)缺血預(yù)處理能夠降低缺血再灌注損傷,然而在臨床實(shí)踐中患者往往在出現(xiàn)缺血后才就診,因此尋找一種腦缺血事件發(fā)生后的保護(hù)方法,具有十分重要的臨床實(shí)用價(jià)值。缺血后處理發(fā)生在缺血事件后具有可控性,因此具有較大的臨床價(jià)值。最早發(fā)現(xiàn)缺血后處理對(duì)心臟的保護(hù)作用[1],近年來國內(nèi)外學(xué)者報(bào)道缺血后處理可以減輕大鼠的腦缺血再灌注損傷[11,12],這和本研究先前的研究結(jié)果一致[7,8],但這一現(xiàn)象發(fā)生的機(jī)制仍然不清楚。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)HSP70表達(dá)水平在缺血后處理組中明顯升高,可能參與后處理保護(hù)效應(yīng)。

圖3 RT-PCR檢測腦皮質(zhì)組織中HSP70mRNA表達(dá)變化 與假手術(shù)組比較,*P＜0.05;與缺血再灌注組比較,#P＜0.05

HSP70是一類最保守、最重要的HSPs,在正常細(xì)胞中水平較低,而在應(yīng)激狀態(tài)下顯著升高,在缺血、缺氧等情況下例如局灶及全腦缺血后受損細(xì)胞內(nèi)的變性蛋白可誘導(dǎo)HSP70表達(dá)。核蛋白變性,暴露出疏水區(qū),并相互作用而聚合,并且與自胞質(zhì)進(jìn)入到胞核內(nèi)的少量HSP70結(jié)合,使得本來與HSP70結(jié)合的熱休克轉(zhuǎn)錄因子(HSF)分離,轉(zhuǎn)移到胞核中與HSP70基因啟動(dòng)子中特定的核苷酸序列即熱休克元件(HSE)結(jié)合,從而啟動(dòng)HSP的轉(zhuǎn)錄,HSP70 m RNA轉(zhuǎn)移到核外大量合成 HSP70,在胞質(zhì)中與變性蛋白結(jié)合,維持蛋白自身穩(wěn)定;進(jìn)入核內(nèi)與核糖體前體及其他核內(nèi)蛋白結(jié)合,防止變性引起生命信息紊亂[13]。

近來的研究證實(shí),在腦缺血再灌注損傷中HSP70的合成增加與缺血耐受現(xiàn)象的產(chǎn)生關(guān)系密切,其機(jī)制包括降低ROS的產(chǎn)生、抑制炎癥反應(yīng)[4]、維持線粒體膜的穩(wěn)定性[5]、抗神經(jīng)元凋亡[6,14]等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,假手術(shù)組僅有少量HSP70表達(dá),缺血再灌注組表達(dá)明顯,與假手術(shù)組比較有顯著差異,這是由于缺血本身為一種應(yīng)激反應(yīng),可誘導(dǎo)HSP70表達(dá),這也是機(jī)體調(diào)動(dòng)內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制,而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。在缺血后處理組HSP70表達(dá)明顯增強(qiáng),提示刺激HSP70表達(dá)水平升高可能是缺血后處理的保護(hù)機(jī)制之一。因此本研究認(rèn)為缺血后處理的保護(hù)作用可能是通過多次循環(huán)復(fù)灌復(fù)停減少了突然再灌注,從而促進(jìn)HSP70 mRNA的轉(zhuǎn)錄和HSP70蛋白的翻譯,進(jìn)而保護(hù)線粒體,減少炎性因子的表達(dá),抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡等途徑而發(fā)揮保護(hù)作用。

由于缺血后處理可在臟器缺血后應(yīng)用,所以具有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值。但是缺血后處理究竟通過什么分子途徑刺激HSP70的表達(dá)和合成還有待進(jìn)一步研究。研究如何啟動(dòng)腦缺血時(shí)機(jī)體的內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)作用,有助于尋找腦缺血的有效治療途徑,對(duì)防治腦梗死后再灌注損傷具有積極意義。

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