狄軍波，陳益平，徐志偉

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬育英兒童醫(yī)院 感染科，浙江 溫州 325027)

接種乙型肝炎疫苗是預(yù)防和控制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染的有力措施。但排除宮內(nèi)感染的因素，仍有約5%～10%的乙型肝炎疫苗接種者經(jīng)常規(guī)的免疫程序后不產(chǎn)生保護(hù)性抗體或抗體水平很低，即無或弱應(yīng)答，其原因可能與遺傳因素、免疫系統(tǒng)疾病或其他慢性疾病以及疫苗因素等有關(guān)。其中遺傳因素特別是與HLA相關(guān)的免疫耐受為研究重點(diǎn)[1]。已有研究表明[2]，接種乙型肝炎疫苗后產(chǎn)生無或弱應(yīng)答的嬰兒其血清白細(xì)胞介素-12（IL-12）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）水平往往明顯低于強(qiáng)應(yīng)答者，其原因可能與抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APC)功能以及共刺激分子的表達(dá)低下，導(dǎo)致IL-12、IL-10等細(xì)胞因子分泌不足有關(guān)。提高疫苗接種時(shí)機(jī)體的IL-12、IL-10分泌水平可能會(huì)提高疫苗接種的成功率。為此，我們觀察了肌內(nèi)注射卡介苗素對(duì)乙型肝炎疫苗接種后無或弱應(yīng)答的嬰兒在復(fù)種疫苗時(shí)血清IL-12和IL-10水平的變化及抗體應(yīng)答情況，探討其作為乙型肝炎疫苗佐劑的價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 2006年1月至2008年12月溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院產(chǎn)科出生按常規(guī)3劑標(biāo)準(zhǔn)程序免疫接種乙型肝炎疫苗的嬰兒（802例），3劑標(biāo)準(zhǔn)程序完成后第8周，定量檢測(cè)乙肝表面抗體的幾何平均滴度(geometric mean titer，GMT)，篩選對(duì)乙型肝炎疫苗無或弱應(yīng)答(GMT<100 U/L)的健康嬰兒60例，分為兩組，即觀察組(乙型肝炎疫苗+卡介苗素組)和對(duì)照組(單純乙型肝炎疫苗組)各30例。

1.2 研究方法 兩組均按0、1、6方案(每次10μg)重組乙型肝炎疫苗(上海生物制品研究所分裝比利時(shí)史克必成公司產(chǎn)品，批號(hào)990503)進(jìn)行再免疫，其中一組同時(shí)肌內(nèi)注射卡介苗素(浙江萬馬藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，商品名：迪蘇)，每次1 mL，每周2次，共三個(gè)月。并在復(fù)種疫苗前及每次接種乙型肝炎疫苗后次日采血2 mL，離心后，留取上清1 mL置冰箱待檢。于復(fù)種后的第8周，平均年齡（15±0.7）月，以抗-HBs定量法檢測(cè)兩組乙肝表面抗體的GMT。

1.3 試劑和儀器 HBV血清標(biāo)志物放免法定量檢測(cè)試劑盒及測(cè)定儀(電化學(xué)發(fā)光，美國羅氏公司提供試劑及測(cè)定儀)；人IL-12、IL-10酶標(biāo)雙抗體夾心法試劑盒(深圳晶美生物工程公司)。

1.4 血清IL-12、IL-10檢測(cè) 嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.5 HBV血清標(biāo)志物放免法定量檢測(cè) 嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用t檢驗(yàn)(等方差)或t’檢驗(yàn)(異方差)和方差分析。

2 結(jié)果

2.1 觀察組和對(duì)照組的血清IL-12和IL-10水平比較 表1、表2顯示，在復(fù)種乙肝疫苗前對(duì)觀察組和對(duì)照組比較差異均無顯著性(P>0.05)；第一次接種后觀察組和對(duì)照組比較差異均無顯著性(P>0.05)；第二、三次復(fù)種后，觀察組IL-10水平均較對(duì)照組明顯升高，兩組比較差異均有顯著性(P＜0.05)；IL-12水平同樣兩組比較差異均有顯著性(P＜0.05)。

表1 乙肝疫苗復(fù)種前、后血清IL-10水平(±s，ng/L)

表1 乙肝疫苗復(fù)種前、后血清IL-10水平(±s，ng/L)

與復(fù)種前比：*P＜0.05；與對(duì)照組比：△P＜0.05；與前一次接種后比：▲P＜0.05

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表2 乙肝疫苗復(fù)種前、后血清IL-12水平±s，ng/L)

表2 乙肝疫苗復(fù)種前、后血清IL-12水平±s，ng/L)

與復(fù)種前比：*P＜0.05；與對(duì)照組比：△P＜0.05；與前一次接種后比：▲P＜0.05

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2.2 接種前、后兩組的血清IL-12和IL-10水平比較 由表1、2顯示，每一次復(fù)種后兩組的IL-12和IL-10水平均較接種前差異有顯著性(P<0.05)；第二、三次復(fù)種后，觀察組的血清IL-12和IL-10水平均較接種前明顯升高，組間兩兩比較差異均有顯著性(P＜0.05)，而對(duì)照組復(fù)種后組間兩兩比較差異無顯著性(P>0.05)。

2.3 觀察組和對(duì)照組的復(fù)種后乙肝表面抗體應(yīng)答水平比較 由表3顯示，觀察組的乙肝表面抗體應(yīng)答水平較對(duì)照組明顯增高，兩組比較有顯著性差異（t=13.22，P<0.01）。

表3 乙肝疫苗復(fù)種后乙肝表面抗體的幾何平均滴度±s，U/L)

表3 乙肝疫苗復(fù)種后乙肝表面抗體的幾何平均滴度±s，U/L)

與對(duì)照組比：*P<0.05

乙肝表面抗體35.6±6.9 60.3±10.4*組別對(duì)照組觀察組

3 討論

在已知免疫應(yīng)答中，T細(xì)胞表面的CD28分子與其配體B7結(jié)合，在防止形成免疫耐受方面起重要作用。IL-12和IL-10是重要的免疫調(diào)控因子[3]。IL-12是T細(xì)胞亞群1型（Th1型）細(xì)胞因子，它不僅可促進(jìn)T細(xì)胞生長和Th1細(xì)胞分化成熟，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，而且還可促進(jìn)B細(xì)胞的增殖、分泌和合成抗體，促進(jìn)γ-干擾素等細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答；IL-10是調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的主要因子，主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，調(diào)節(jié)T細(xì)、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等的分化和增殖。它是一種雙抑制的反饋因子，對(duì)Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞增殖有雙向調(diào)節(jié)作用，IL-10、IL-12的產(chǎn)生水平可能直接影響機(jī)體在接受外來抗原刺激時(shí)抗體的免疫應(yīng)答能力。文獻(xiàn)表明乙肝表面抗體產(chǎn)生低下的人群中共刺激分子CD80和CD28表達(dá)不足，IL-12和IL-10分泌低下[4]，該人群即使給予多次的疫苗刺激往往也不能使其產(chǎn)生足夠的抗體，國內(nèi)外研究表明IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γ、 GMCSF(粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子)均能改善小鼠免疫應(yīng)答能力，從而顯著增加DNA疫苗誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生[5]。

國內(nèi)外對(duì)使用疫苗佐劑增加接種效果的研究結(jié)果表明，磷酸鋁、SBAS4(鋁劑+S-O脫酰單磷酰脂質(zhì)A復(fù)合物)等作為乙型肝炎疫苗佐劑，是通過增加免疫原與巨噬細(xì)胞的相互作用，增加向T細(xì)胞呈遞抗原來增強(qiáng)對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答，但由于其常需與基因疫苗聯(lián)合，目前未能廣泛應(yīng)用。上世紀(jì)末有學(xué)者也曾以GM-CSF作為健康成人乙型肝炎疫苗接種的免疫佐劑，結(jié)果提示80μg和250μg的劑量不能起明顯的佐劑作用[6]?？ń槊缢仄溆行С煞諧pG-ODN2006是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的人特異性CpG序列[7-8]，能誘導(dǎo)多種免疫細(xì)胞的活化，它通過調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)細(xì)胞免疫與體液免疫，刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，激活單核-巨噬細(xì)胞功能，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，BCG細(xì)胞壁上的相關(guān)脂多糖能誘導(dǎo)IFN-γ、IL-12產(chǎn)生，促進(jìn)Th1分化和大量巨噬細(xì)胞聚集活化[9]，研究證實(shí)，BCG刺激后，T24細(xì)胞表面的鐘聲蛋白樣受體(TLR)2和TLR4表達(dá)水平以及IL-12的分泌量增加，且隨BCG劑量增加而升高[10]?？ń槊缢匾驯粦?yīng)用于老年慢性阻塞性肺疾病(COPD)的防治[11]，并在抗腫瘤免疫和支氣管哮喘防治中有良好的作用，已被廣泛應(yīng)用于臨床[12]，但鮮見其作為佐劑與疫苗聯(lián)合使用的報(bào)道。本組資料中，兩組在每次接受乙肝疫苗刺激后IL-12和IL-10的水平均有升高，較刺激前差異有顯著性，表明兩組T細(xì)胞的功能不存在一般的免疫缺陷，這與國外的報(bào)道一致[13]。第二、第三次疫苗接種后雖兩組的IL-12和IL-10水平上升，但觀察組上升幅度明顯超過對(duì)照組，差異有顯著性，說明經(jīng)過注射卡介苗素后，機(jī)體在接受抗原刺激時(shí)產(chǎn)生IL-12、IL-10等細(xì)胞因子的能力增加；但是在第一次復(fù)種后對(duì)照組與觀察組血清IL-12和IL-10的水平相仿，差異不顯著，考慮與卡介苗素使用時(shí)間短，尚未發(fā)揮作用有關(guān)。此外，在疫苗的三次復(fù)種過程中，觀察組每次疫苗復(fù)種后IL-12和IL-10水平均較前一次遞增，組內(nèi)比較差異有顯著性，證實(shí)IL-12和IL-10的分泌量可隨BCG劑量增加而升高，表明肌內(nèi)注射卡介苗素可以調(diào)節(jié)抗體無或弱應(yīng)答嬰兒的細(xì)胞免疫功能，使其IL-10、IL-12等細(xì)胞因子分泌增加。在三次復(fù)種結(jié)束后卡介苗注射組的乙肝表面抗體幾何平均滴度較對(duì)照組明顯升高，說明卡介苗素的確能提高嬰兒在再免疫時(shí)的抗體應(yīng)答水平。卡介苗素有望作為一種較好的疫苗佐劑，為提高乙型肝炎疫苗的應(yīng)答水平開辟新的途徑。

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