張亞麗，董琳，陳小芳，周曉聰，李錦燕，李孟榮

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬育英兒童醫(yī)院 呼吸科，浙江 溫州 325027)

呼吸道合胞病毒（RSV）是嬰幼兒下呼吸道感染最常見的病原，研究顯示，RSV感染的氣道上皮細(xì)胞能產(chǎn)生調(diào)節(jié)激活正常T細(xì)胞表達(dá)、分泌的細(xì)胞因子（RANTES）和單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）等趨化因子，從而引發(fā)過度的氣道炎癥反應(yīng)[1-2]。RSV感染患兒鼻腔盥洗液及鼻咽分泌物RANTES水平明顯增高，且與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[3-4]，有低氧表現(xiàn)的RSV毛細(xì)支氣管炎患兒鼻炎分泌物中MCP-1水平明顯升高[5]，提示趨化因子可能在RSV感染發(fā)病中發(fā)揮重要作用。幾乎所有兒童2歲時均感染RSV，但僅1%～2%需住院治療，造成病情差異的原因尚不清楚，許多嚴(yán)重RSV感染患兒并不存在早產(chǎn)、先天性心臟病、支氣管肺發(fā)育不良等高危因素，因此，宿主的遺傳因素與RSV感染發(fā)病的關(guān)系正成為研究的焦點。既往研究已證實調(diào)控RANTES和MCP-1的基因位點存在多態(tài)性[6-7]。本研究通過病例-對照分析，探討RANTES-403G/A、MCP-1-2518A/G的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與RSV毛細(xì)支氣管炎易感性的相關(guān)性，篩選與疾病易感性相關(guān)的SNP位點。

1 對象和方法

1.1 對象 病例組為2006年11月-2007年3月入住溫州醫(yī)學(xué)院附屬育英兒童醫(yī)院呼吸科，診斷為RSV毛細(xì)支氣管炎患兒150例，其中男111例，女39例，年齡1～24個月，有早產(chǎn)、雙胎、先天性心臟病、支氣管肺發(fā)育不良、免疫缺陷等基礎(chǔ)疾病者除外。對照組選擇同期健康體檢的兒童120例，男92例，女28例，年齡2～24個月。兩組均無特應(yīng)性疾病史及家族特應(yīng)性疾病史，均為漢族，無血緣關(guān)系。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提?。河肅helex-100快速提取法提取基因組DNA。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性酶切片段長度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)檢測：各位點信息、引物、產(chǎn)物長度、PCR反應(yīng)條件及限制性內(nèi)切酶見表1。PCR反應(yīng)體系為20μL：Primer F(10μmol/L)1μL，Primer R(10μmol/L)1μL，dNTPMix(2 mmol/L)2μL，MgCl2（25 mmol/L）1.6μL，10×Buffer 2μL，DNA模板2μL，Taq DNA聚合酶(1U/μL)1.5μL，去離子水8.9μL。取PCR產(chǎn)物5μL，限制性內(nèi)切酶3 U，10×Buffer 1μL，余用去離子水補齊，總體積為10μL，37 ℃水浴箱中酶切過夜。30 g/L瓊脂糖凝膠鑒定基因型(見圖1、圖2)。

表1 各位點的基本信息、引物、反應(yīng)條件、產(chǎn)物產(chǎn)度及限制性內(nèi)切酶

圖1 RANTES-403G/A位點PCR-RFLP電泳圖譜

圖2 MCP-1-2518G/A位點PCR-RFLP電泳圖譜

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 基因型與等位基因頻率Hardy-Weinburg平衡吻合程度用x2檢驗；基因型及等位基因頻率的比較用x2檢驗；用Logistic回歸模型判斷等位基因型對發(fā)病危險度的影響。

2 結(jié)果

2.1 RANTES-403G/A基因型及等位基因分布 病例組和對照組均可見GG、GA、AA 3種基因型，以GA雜合子基因型為主；經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗，對照組的遺傳平衡，表明該群體來自同一孟德爾群體(x2=0.052，P＞0.05)；而病例組的遺傳不平衡(x2=10.894，P＜0.05)。兩組基因型頻率差異有顯著性(x2=10.024，P＜0.05)；病例組A等位基因的頻率明顯高于對照組(x2=3.912，P＜0.05)(見表2)；與G等位基因攜帶者相比，A等位基因攜帶者患RSV毛細(xì)支氣管炎的風(fēng)險明顯增加 (OR=1.415，95%CI:1.003～1.996，P＜0.05)。2.2 MCP-1-2518A/G基因型及等位基因分布 病例組和對照組均可見GG、GA、AA 3種基因型，以GA雜合子基因型為主；經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗，對照組的遺傳平衡(x2=0.468，P＞0.05)；而病例組的遺傳不平衡(x2=8.153，P＜0.05)。兩組基因型和等位基因型頻率差異均無顯著性(見表 3)。

表2 RANTES-403G/A基因型及等位基因分布

3 討論

RANTES基因位于人染色體17q11.2-q12，該區(qū)域與哮喘等特應(yīng)性疾病基因連鎖，目前，RANTES基因啟動子區(qū)研究最多的3個多態(tài)性位點分別為-403G/A、-109T/C、-28C/G。其中-403位點G/A的變異，可能對其基因轉(zhuǎn)錄造成影響，從而影響疾病的發(fā)生發(fā)展。Fryer等[8]發(fā)現(xiàn)白人哮喘和特應(yīng)性個體-403A等位基因頻率高于正常個體，推斷-403A與哮喘易感性和特應(yīng)性有關(guān)。文慣宇等[9]也報道-403A可能是特應(yīng)性體質(zhì)的易感因素，但未發(fā)現(xiàn)RANTES-403G/A位點基因多態(tài)性與RSV毛細(xì)支氣管炎的相關(guān)性。Amanatidou等[10]的研究則發(fā)現(xiàn)，RANTES基因-28C/G、-403G/A和Aln1.1T/C位點與RSV毛細(xì)支氣管炎的易感性均無關(guān)，但基因型同時為-28C/C、-403G/A和Aln1.1T/T的個體易患該病。本研究結(jié)果顯示溫州地區(qū)RSV毛細(xì)支氣管炎患兒和正常兒童均存在GG、GA和AA 3種基因型，兩組基因型頻率差異有顯著性，RSV毛細(xì)支氣管炎組RANTES-403A等位基因頻率高于對照組，與攜帶G等位基因個體相比，攜帶A等位基因的個體患毛細(xì)支氣管炎風(fēng)險增加了1.415倍，提示RANTES-403A等位基因與RSV毛細(xì)支氣管炎易感性相關(guān)，可能是影響RSV毛細(xì)支氣管炎發(fā)病的一個重要候選基因。

MCP-1編碼基因位于人染色體17q11.2，由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成，該段基因亦與哮喘等特應(yīng)性疾病基因連鎖。目前，MCP-1啟動子區(qū)研究最多的兩個多態(tài)性位點為-2518G/A和-2076A/T。Rovin等[7]報道MCP-1-2518位點基因多態(tài)性影響MCP-1的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平，MCP-1-2518G等位基因能使MCP-1轉(zhuǎn)錄增多，從而使其蛋白表達(dá)水平上調(diào)。Szalai等[11]發(fā)現(xiàn)MCP-1-2518G等位基因可增加嬰幼兒哮喘的易感性，并與病情相關(guān)。目前國內(nèi)外尚無MCP-1-2518G/A基因多態(tài)性與RSV感染發(fā)病的報道，本研究未發(fā)現(xiàn)MCP-1-2518G/A基因多態(tài)性與RSV毛細(xì)支氣管炎易感性之間存在關(guān)聯(lián)。

綜上所述，本研究結(jié)果提示RANTES-403A可能是影響RSV毛細(xì)支氣管炎發(fā)病的一個重要候選基因，盡管未發(fā)現(xiàn)MCP-1-2518G/A基因多態(tài)性與RSV毛細(xì)支氣管炎易感性之間存在關(guān)聯(lián)，但RANTES和MCP-1位于同一染色體的同一區(qū)段，兩位點所形成的單體型與RSV毛細(xì)支氣管炎易感性是否相關(guān)，有待進(jìn)一步探討。另外，RANTES基因多態(tài)性只能部分解釋RSV毛細(xì)支氣管炎的易感性，本課題組其他研究發(fā)現(xiàn)TNF-α-308A等位基因、IL-8-251A與781C等位基因形成的AC單體型均與RSV毛細(xì)支氣管炎的易感性相關(guān)，這些易感基因相互之間是否存在聯(lián)合或協(xié)同作用，目前尚不明了，有待今后進(jìn)一步研究。

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