李 嘉, 張 兵, 鐘禮立, 王曼知

2.湖南省人民醫(yī)院兒科。

近年來,由于細(xì)菌耐藥株的日益增多,從新的角度研發(fā)抗感染物質(zhì),成為全球醫(yī)藥界面臨的緊迫問題,抗菌肽的研究為這一問題的解決帶來了希望。人 β防御素-3(human β-defensin-3,hBD-3)是最為引人注目的抗菌肽。它不僅具有廣譜抗微生物活性,而且能通過 Toll樣受體(Toll-like receptors,T LR)的介導(dǎo),連接先天和獲得性免疫應(yīng)答,保護(hù)黏膜和上皮細(xì)胞免受感染[2],成為抗感染研究熱點(diǎn)之一。但由于外源性 hBD-3獲取難度大、費(fèi)用昂貴[3],在體內(nèi)的活性可能被體液抑制[4]等原因,難以應(yīng)用于臨床,故探索適當(dāng)?shù)膬?nèi)源性hBD-3誘導(dǎo)途徑成為該領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。因此,了解內(nèi)源性hBD-3的表達(dá)與誘導(dǎo)物的濃度以及誘導(dǎo)時間長短的關(guān)系有積極意義。急性呼吸道感染是我國兒童的常見病,所以,本研究以人支氣管上皮細(xì)胞為對象,選擇多種革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)為誘導(dǎo)物,觀察不同濃度、不同時間LPS誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞后hBD-3的表達(dá)變化,為人工誘導(dǎo)、調(diào)控內(nèi)源性hBD-3的表達(dá)增強(qiáng)其在體內(nèi)的抗菌活性,從而為治療呼吸道感染打下基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料

(一)細(xì)胞株 人支氣管上皮細(xì)胞(HBEC)(購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院湘雅細(xì)胞中心)。

(二)主要試劑 新生牛血清(FCS)(杭州四季青公司),1640(美國 GIBCO公司),LPS(E.coli L2880)及瓊脂糖(Sigma公司),T rizol(invitrogen公司),RT試劑盒(Fermentas公司),TAG酶及dNTP(tiangen公司),二乙基焦碳酸酯(DEPC)(北京鼎國生物技術(shù)公司),hBD-3引物及陽性對照β-actin引物由上海英駿生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,兔抗人hBD-3抗體(absun公司),辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉公司)。

二、方法

(一)實(shí)驗(yàn)分組 生長良好人支氣管上皮細(xì)胞隨機(jī)分為5組,分別為對照組和4個不同濃度LPS組。其中,對照組加入含10%FCS的1640培基5 mL,LPS組又分為4組,分別加入含 LPS濃度為0.01、0.1、1和10 mg/L的10%FCS的1640培基5 mL,各組均置于培養(yǎng)箱(37℃,5%CO2)中培養(yǎng),然后在誘導(dǎo)4 h后行免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測hBD-3蛋白的表達(dá);分別在誘導(dǎo) 1、2、4和8 h后行 RT-PCR檢測hBD-3 mRNA的表達(dá)。

(二)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測hBD-3蛋白的表達(dá)取生長良好的支氣管上皮細(xì)胞,0.25%胰蛋白酶消化后,調(diào)細(xì)胞濃度為1×107個/mL,細(xì)胞懸液接種在預(yù)先放置清潔無菌干燥蓋玻片的6孔板中,放入37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后倒置顯微鏡下見細(xì)胞貼壁。對照組和LPS組(0.1 mg/L)分別誘導(dǎo)4 h后檢測蛋白表達(dá)。一抗為兔抗人hBD-3抗體(1∶100稀釋),二抗為辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG。對照組用PBS代替一抗。

(三)RT-PCR檢測 hBD-3mRNA的表達(dá) 取不同實(shí)驗(yàn)組的支氣管上皮細(xì)胞,分別在LPS誘導(dǎo)1、2、4和8 h后采用Trizol法抽提RNA。依吸光度值,取等量總 RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,含1 μ L隨機(jī)引物,2 μ L dNTP,1 μ L 反轉(zhuǎn) 錄酶(MMLV), 總體積 20 μ L。反應(yīng)條件為：70 ℃5 min,37 ℃5 min,42℃60 min,70℃10 min。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,采用Tag酶,按以下程序進(jìn)行 PCR。上游引物為：5′-AGCCTAGCAGCTATGAGGATC-3′,下 游 引 物為 ：5′-CTTCGGCAGCAT TT TCGGCCA-3′,產(chǎn) 物長206 bp。反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性5 min,再經(jīng)94℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸30 s共32個循環(huán),最后72℃延伸7 min。產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳。同時設(shè)陽性對照β-actin,產(chǎn)物長450 bp。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測hBD-3蛋白表達(dá)

對照組人支氣管上皮細(xì)胞中hBD-3蛋白有微量表達(dá),胞質(zhì)呈淡棕色顆粒。用0.1 mg/L的LPS誘導(dǎo)細(xì)胞4 h后,用hBD-3多克隆抗體染色,可見培養(yǎng)的支氣管上皮細(xì)胞胞質(zhì)中hBD-3蛋白明顯表達(dá),呈棕褐色陽性顆粒,結(jié)果見圖1。

二、RT-PCR檢測hBD-3 mRNA的表達(dá)

(一)對照組人支氣管上皮細(xì)胞hBD-3 mRNA的表達(dá) 發(fā)現(xiàn)對照組人支氣管上皮細(xì)胞中 hBD-3 mRNA有微量表達(dá),不同時間組間(1、2、4和8 h)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,結(jié)果見表1、圖2。

(二)LPS誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞hBD-3mRNA表達(dá)的量效關(guān)系 用不同濃度的LPS(0.01、0.1、1、10 mg/L)誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞后,在每個相同時間點(diǎn)(1、2、4和8 h)hBD-3mRNA表達(dá)均隨之增多,且在上述濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴型,不同濃度組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),結(jié)果見表1、圖3。

圖1 hBD-3蛋白表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果FIG.1.The immunocytochemical stain showing hBD-3 expression

圖2 對照組HBEC hBD-3mRNA的表達(dá)FIG.2.The expression of hBD-3 mRNA in HBECs in control group

(三)LPS誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞hBD-3mRNA表達(dá)的時效關(guān)系 每一相同濃度LPS(0.01、0.1、1和10 mg/L)在誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞不同時間(1、2、4和8 h)后,隨時間增加hBD-3 mRNA表達(dá)量亦增加,在同一濃度組呈時間相關(guān)性,不同時間組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。hBD-3 mRNA表達(dá)的半定量結(jié)果以hBD-3/β-actin吸光度的相對值計(jì)算,結(jié)果見表1、圖4。

(四)LPS濃度與hBD-3 mRNA表達(dá)的相關(guān)性從圖5可見,每個相同時間點(diǎn)LPS濃度與hBD-3mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)(1、2、4和8 h的r=0.98,P＜0.01)。同一濃度下,LPS誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞8 h后所產(chǎn)生的hBD-3 mRNA明顯高于1 h組,并且這種差距隨誘導(dǎo)濃度增加而增大。

圖3 LPS誘導(dǎo)HBEC不同時間后hBD-3mRNA的表達(dá)FIG.3.The expression of hBD-3 mRNA in HBECs induced by LPS for different times

表1 不同濃度 LPS不同時間點(diǎn)hBD-3mRNA的表達(dá)(±s)(n=8)Table 1.The mRNA expression of hBD-3 at different time points after stimulation by different concentrations of LPS(±s)(n=8)

表1 不同濃度 LPS不同時間點(diǎn)hBD-3mRNA的表達(dá)(±s)(n=8)Table 1.The mRNA expression of hBD-3 at different time points after stimulation by different concentrations of LPS(±s)(n=8)

*P＜0.01 versus control;▼P＜0.01 versus the previous lower concentration;▲P＜0.01 versus the previous time point.

0(control) 0.10±0.005 0.11±0.003 0.09±0.004 0.11±0.007 0.01 0.13±0.002* 0.16±0.007*▲ 0.20±0.003*▲ 0.24±0.006*▲0.1 0.18±0.009*▼ 0.22±0.003*▼▲ 0.26±0.002*▼▲ 0.31±0.003*▼▲1 0.22±0.003*▼ 0.27±0.008*▼▲ 0.34±0.011*▼▲ 0.43±0.004*▼▲10 0.27±0.011*▼ 0.35±0.010*▼▲ 0.42±0.009*▼▲ 0.51±0.010*▼▲

圖4 不同濃度LPS誘導(dǎo)HBEC不同時間后hBD-3mRNA的表達(dá)FIG.4.The expression of hBD-3 mRNA in HBECs induced by different concentrations of LPS for different times

圖5 LPS濃度與hBD-3 mRNA表達(dá)的相關(guān)關(guān)系FIG.5.Relationship between LPS concentration and the expression level of hBD-3 mRNA

討 論

宿主的防御功能和病原體毒力的相互作用是感染發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵。細(xì)菌除具有毒力外,還需要足夠的數(shù)量才能引起感染。細(xì)菌數(shù)量越多,釋放的毒素越多,產(chǎn)生的毒力越強(qiáng),炎癥反應(yīng)越重。本研究選擇不同濃度LPS誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞,是為了研究不同數(shù)量的細(xì)菌毒素在人體下呼吸道產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)所導(dǎo)致hBD-3表達(dá)強(qiáng)弱的變化,從而探討如何采用可調(diào)控方式誘導(dǎo)其分泌;選擇不同誘導(dǎo)時間是為了了解hBD-3表達(dá)在誘導(dǎo)后何時起效,持續(xù)的時間多長。

本研究利用多種革蘭陰性菌死亡后釋放的產(chǎn)物L(fēng)PS誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞,觀察hBD-3能否被誘導(dǎo)表達(dá)。通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色我們發(fā)現(xiàn),人支氣管上皮細(xì)胞胞質(zhì)中有淡棕色顆粒,有微量hBD-3蛋白表達(dá);用一定濃度的LPS誘導(dǎo)4 h后,可見培養(yǎng)的支氣管上皮細(xì)胞胞質(zhì)中有棕褐色陽性顆粒,hBD-3蛋白表達(dá)明顯,證實(shí)hBD-3在人支氣管上皮細(xì)胞有表達(dá)并能被誘導(dǎo)。

本研究采用半定量RT-PCR發(fā)現(xiàn),LPS在一定濃度范圍(0.01～10 mg/L)內(nèi)誘導(dǎo)hBD-3mRNA的表達(dá)呈劑量依賴性;每一相同時間點(diǎn)LPS濃度與hBD-3 mRNA表達(dá)呈正相關(guān);同一濃度下,LPS誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞8 h后所產(chǎn)生的hBD-3 mRNA明顯高于1 h組,并且這種差距隨誘導(dǎo)濃度增加而增大。推測隨著細(xì)菌數(shù)量增多,毒素增多,感染加重,hBD-3分泌亦增加,機(jī)體抵抗細(xì)菌感染的能力也增加,可能在局部免疫防御反應(yīng)中起著重要作用。本研究誘導(dǎo)物的劑量范圍為0.01～10 mg/L,是參考了廖偉等[5]的報(bào)道,當(dāng)劑量＜0.01 mg/L時,機(jī)體是否會被誘導(dǎo)表達(dá),＞10 mg/L時,是否會引起過激反應(yīng)而對機(jī)體有害,目前尚不清楚,有待我們進(jìn)一步研究。

本研究中,我們利用LPS誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞后,用RT-PCR檢測不同時間細(xì)胞中hBD-3的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)hBD-3 mRNA在誘導(dǎo)后1 h即有較強(qiáng)表達(dá),并隨著時間增加表達(dá)亦隨之上調(diào),在一定時間范圍(1～8 h)內(nèi)呈時間相關(guān)性,表明hBD-3 mRNA的誘導(dǎo)表達(dá)具有明顯的時效關(guān)系。推測當(dāng)細(xì)菌侵襲下呼吸道時,hBD-3在短時間內(nèi)即可誘導(dǎo)表達(dá),是一個即早應(yīng)答事件,參與氣道最初的防御反應(yīng)。在沒有LPS誘導(dǎo)下,人支氣管上皮細(xì)胞在不同時間點(diǎn)所產(chǎn)生的hBD-3 mRNA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,推測正常人體內(nèi)支氣管上皮細(xì)胞hBD-3呈恒定表達(dá),細(xì)菌感染在誘導(dǎo)hBD-3表達(dá)中占據(jù)重要地位,一旦機(jī)體受到外界病原體入侵時,即可能通過自身防御機(jī)制增強(qiáng)hBD-3表達(dá),起到抗感染作用。

鐘小林等[6]在用 LPS誘導(dǎo)小鼠心、肝、脾、肺、腎各組織后,僅在肝臟組織中檢測到hBD-3 mRNA的表達(dá),并在注射后6 h才出現(xiàn),8、10 h達(dá)峰值,12 h后表達(dá)水平下降。本研究與之相比,誘導(dǎo)表達(dá)時間出現(xiàn)較早,考慮與hBD-3在呼吸道上皮細(xì)胞中表達(dá)相對較多以及不同物種和細(xì)胞中信號傳導(dǎo)途徑可能不一樣有關(guān)。本研究未看到hBD-3表達(dá)的衰減,可能因觀察時間尚不夠長所致。在下一步的研究中,可進(jìn)一步觀察隨時間增加hBD-3表達(dá)的變化及有無衰減的過程,為研究hBD-3治療的時間窗及藥動學(xué)打下基礎(chǔ)。

hBD-3乃至抗菌肽功能的深入研究需得到有活性的肽,在抗菌過程中真正起作用的也是蛋白。急性時相反應(yīng)蛋白在疾病的早期輔助診斷和監(jiān)測以及對機(jī)體的保護(hù)作用中至關(guān)重要。相對于鐘小林等[6]僅從基因水平上研究hBD-3的表達(dá)不同,本課題的前期研究中還從蛋白水平研究了hBD-3表達(dá)的變化,同樣發(fā)現(xiàn)正常人支氣管上皮細(xì)胞中hBD-3蛋白有微量表達(dá)[7],用不同濃度LPS誘導(dǎo)培養(yǎng)的上皮細(xì)胞,4 h后即出現(xiàn)hBD-3蛋白的明顯表達(dá),并在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性。進(jìn)一步說明了 hBD-3與LPS的劑量依賴關(guān)系,為以后hBD-3作為抗菌物質(zhì)的使用打下基礎(chǔ)。

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