顏 彥，方肇勤△，劉小美，潘志強(qiáng)，盧文麗，梁 超，吳中華，高必峰

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203;2.科羅拉多大學(xué)醫(yī)學(xué)院，美國(guó)丹佛 CO 80262)

我們前期通過業(yè)已建立的小鼠四診工作站及其系列標(biāo)準(zhǔn)[1～4]，對(duì) H22荷瘤小鼠進(jìn)行辨證，篩選出早期邪毒壅盛證、氣虛證、中期陽氣虛證、中晚期氣陰陽虛證等3個(gè)階段4個(gè)常見證型，繼而采用Affymetrix的GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array基因芯片對(duì)上述4種證型小鼠下丘腦、垂體、腎上腺、甲狀腺、睪丸、胸腺、脾臟和腫瘤等8種組織進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)生后，這些組織出現(xiàn)大量的基因表達(dá)和剪接差異。本文重在關(guān)注腫瘤發(fā)生后下丘腦在3階段4個(gè)證候中一致上調(diào)或下調(diào)且至少有1個(gè)證候表達(dá)量大于1000的基因，共30個(gè)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

昆明種雄性小鼠250只，體重25g±1g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(滬)2003-0003。

1.2 試劑與儀器

Trizol試劑和RNeasy Mini Kit試劑盒分別購自美國(guó)GIBCO BRC和德國(guó)QIAGEN公司，RNA Nano LabChip及其配套的 Agilent-bioanalizer2100。GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array及其試劑盒(2006年)。四診計(jì)量化檢測(cè)設(shè)備見相關(guān)文獻(xiàn)[2];芯片檢測(cè)儀器包括雜交爐、芯片洗滌系統(tǒng)、芯片掃描儀等均購自美國(guó)Affymetrix公司。

2 方法

2.1 分組及處理

隨機(jī)取60只作正常對(duì)照，另190只腋下接種H22腫瘤腹水癌細(xì)胞0.2ml(濃度4×107個(gè)/ml)，出瘤后淘汰40只出瘤不佳及畸形小鼠，剩余150只。取正常小鼠20只及荷瘤小鼠150只，共計(jì)170只用于四診計(jì)量檢測(cè)和辨證，另40只正常對(duì)照小鼠不做四診檢測(cè)，常規(guī)飼養(yǎng)。

2.2 四診計(jì)量化檢測(cè)方法與計(jì)量辨證方法

參見有關(guān)文獻(xiàn)[1～3]。

2.3 荷瘤小鼠分期與常見證候的確定

依據(jù)以往的研究，H22荷瘤小鼠分期標(biāo)準(zhǔn)參見有關(guān)文獻(xiàn)[4]。分別于接種腫瘤后第7天(早期)、第20天(中期)、第28天(中晚期)進(jìn)行全體小鼠四診檢測(cè)與辨證。并分別于檢測(cè)后的次日，即接種腫瘤后第8天(早期)，辨證并篩選出最為典型的邪毒壅盛、氣虛證候小鼠各16只;第21天(中期)辨證并篩選出最為典型的陽氣虛證候小鼠16只;第29天(中晚期)辨證并篩選出最為典型的氣陰陽虛證候小鼠16只。

2.4 不同證候荷瘤小鼠的處死與取材

在小鼠四診檢測(cè)與辨證的次日，即分別于接種腫瘤后第8天，處死邪毒壅盛、氣虛證荷瘤小鼠，以及正常對(duì)照小鼠各16只;第21天處死陽氣虛荷瘤小鼠和正常對(duì)照小鼠各16只，第29天處死氣陰陽虛荷瘤小鼠和正常對(duì)照小鼠各16只，分別取下丘腦、垂體、甲狀腺、腎上腺、睪丸、胸腺、脾臟和腫瘤組織，稱重和計(jì)算各組織與正常對(duì)照小鼠對(duì)應(yīng)組織重量均數(shù)的比值。

2.5 RNA的提取與檢測(cè)

以上共5組樣本采用Trizol(GIBCO BRC)試劑盒及其方法，抽提以上組織總RNA，16個(gè)組織樣本合并混勻;采用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)試劑盒及其方法純化RNA;采用RNA Nano LabChip和方法，及其配套的Agilent-bioanalizer2100檢測(cè)RNA的質(zhì)量和電泳圖譜。

2.6 芯片檢測(cè)

采用Affymetrix的GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array及其試劑盒所建議的檢測(cè)方法。依據(jù)檢測(cè)結(jié)果和Affymetrix建議的方法，采用iterPlier法計(jì)算核心基因表達(dá)讀數(shù)值以及外顯子剪接差異分析。以上RNA檢測(cè)和芯片檢測(cè)委托上海生物芯片有限公司完成。

2.7 下丘腦在3階段4個(gè)證候中一致上調(diào)或下調(diào)且至少有1個(gè)證候表達(dá)量大于1000的基因的篩選

(1)選取5組(正常和4個(gè)證候組)表達(dá)量至少有1組≥432(5組所有基因表達(dá)的均數(shù))的基因，共6035個(gè)，此步驟保證初步表達(dá)量;(2)篩選4個(gè)證候與正常組比值至少有1組大于或等于1.5，以及小于或等于0.67的基因，共2109個(gè);(3)篩選一致上調(diào)的基因:4個(gè)證候與正常組比值一致大于1.5，且至少有1個(gè)證候大于1000的基因;(4)篩選一致下調(diào)的基因:4個(gè)證候與正常組比值一致小于0.67的基因。

2.8 基因信息查詢

中文搜索CNKI、VIP等數(shù)據(jù)庫，英文主要參考NCBI數(shù)據(jù)庫中的 PubMed、OMIM、OMIA等收載的文獻(xiàn)。

3 結(jié)果

3.1 分期處死的荷瘤小鼠

整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，先后分3階段處死4個(gè)不同證候荷瘤小鼠計(jì)64只，即腫瘤早期的“邪毒壅盛證”、“氣虛證”，中期的“陽氣虛證”(氣虛兼有陽虛)和中晚期的“氣陰陽虛”兼證各16只。實(shí)驗(yàn)中自然死亡32只，尚存活54只，并涉及一些其他復(fù)合證。

3.2 荷瘤小鼠下丘腦差異表達(dá)的基因數(shù)

荷瘤小鼠下丘腦一致上調(diào)且至少有1個(gè)證候大于1000的基因共27個(gè)，其中氣虛證表達(dá)最大的11個(gè)，陽氣虛證表達(dá)最大的1個(gè)，氣陰陽虛證表達(dá)量最大的15個(gè)，一致下調(diào)的基因共3個(gè)。

3.3 荷瘤小鼠下丘腦一致上調(diào)的基因

3.3.1 荷瘤小鼠早期氣虛證下丘腦表達(dá)上調(diào)的基因 表1顯示，荷瘤小鼠早期氣虛證下丘腦表達(dá)上調(diào)且芯片讀數(shù)計(jì)算值大于1000的基因共11個(gè)。

Lphn1為 7TM-受體外緣凝集素樣結(jié)構(gòu)域。7TM-受體被認(rèn)為是信號(hào)傳輸過程中的信號(hào)轉(zhuǎn)換器，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。對(duì)拉特羅毒素有強(qiáng)吸引，可引發(fā)大規(guī)模神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的胞吐作用。有報(bào)道認(rèn)為其可能與胞吐調(diào)節(jié)有關(guān)，具體機(jī)制不詳[5]。

Ctxn1在前腦發(fā)育過程中調(diào)節(jié)皮質(zhì)神經(jīng)元的細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳遞。

Syn1是突觸蛋白家族成員，人類補(bǔ)體旁路途徑的正調(diào)節(jié)物，分布在突觸膜泡和突觸小泡的細(xì)胞質(zhì)表面，與細(xì)胞骨架相結(jié)合，參與突觸傳遞和神經(jīng)遞質(zhì)分泌的調(diào)節(jié)，對(duì)突觸功能障礙和衰老過程中神經(jīng)細(xì)胞的生存有重要影響。Syn1的細(xì)胞缺失會(huì)導(dǎo)致抑郁與癲癇[6]。

Ttyh3與氯離子通道有關(guān)。編碼蛋白質(zhì)的功能是鈣離子激活大量氯離子通道進(jìn)行信息傳遞。

Npcd是帶有染色質(zhì)域的神經(jīng)元五聚環(huán)蛋白，主要存在于細(xì)胞體、凸起以及生長(zhǎng)錐中，與神經(jīng)元的質(zhì)膜內(nèi)側(cè)相關(guān)，Npcd可能與軸突生長(zhǎng)或?qū)蛴嘘P(guān)，可影響神經(jīng)生長(zhǎng)因子，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分化[7]。

Nr1d1是核受體亞家族成員，參與和調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄過程，通過影響生物節(jié)律來調(diào)節(jié)代謝，對(duì)調(diào)節(jié)血脂、核脂蛋白代謝、脂肪形成和血管炎癥有重要作用[8]。

表1 荷瘤小鼠早期氣虛證下丘腦表達(dá)上調(diào)的基因(芯片讀數(shù)計(jì)算值)

Nt5dc3能選擇性地與核苷酸相互作用，形成核糖核蛋白復(fù)合物，可能參與RNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，具體功能未見文獻(xiàn)報(bào)道。

C530028O21Rik的功能不清楚。

CD74可通過影響MHCⅡ類抗原分子多肽的組裝及其基因的表達(dá)，在抗原呈遞過程中發(fā)揮重要作用。研究顯示，細(xì)胞表面CD74可控制成熟B細(xì)胞的存活率[9]。CD74表達(dá)量增加，提示機(jī)體的免疫機(jī)能可能較活躍。

Nfix在病毒和細(xì)胞的啟動(dòng)因子和復(fù)制起始區(qū)中識(shí)別和結(jié)合回文序列 5′-TTGGCNNNNNGCCAA-3′，這些蛋白單獨(dú)能夠激活轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。對(duì)維持大腦發(fā)育和神經(jīng)干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)有重要作用[10]。

Mast3是絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員，研究表明該基因與大腦神經(jīng)活動(dòng)密切相關(guān)，傳遞信息。有研究顯示，其在海馬樣癲癇中表達(dá)量上升[11]。

以上 Ctxn1、Lphn1、Npcd、Syn1、Mast3、Ttyh3 均與細(xì)胞特別是神經(jīng)細(xì)胞的信號(hào)傳遞有關(guān)，Nfix、Nr1d1、Nt5dc3與基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯有關(guān)，CD74與機(jī)體的免疫功能有關(guān)。腫瘤發(fā)生后，4個(gè)常見證候荷瘤小鼠下丘腦的這些基因一致上調(diào)，其中又以氣虛證表達(dá)量最高，提示荷瘤小鼠下丘腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞間相互作用增強(qiáng)，以早期的氣虛證為甚。下丘腦的一些神經(jīng)元既能分泌激素(神經(jīng)激素)，具有內(nèi)分泌細(xì)胞的作用;又保持典型神經(jīng)細(xì)胞的功能，可合成調(diào)節(jié)腺垂體激素分泌的肽類物質(zhì)。這些肽類物質(zhì)合成后必須經(jīng)軸突運(yùn)輸?shù)秸新∑?，由此?jīng)垂體門脈系統(tǒng)到達(dá)腺垂體，促進(jìn)或抑制某種腺垂體激素的分泌。由以上結(jié)果推測(cè)腫瘤發(fā)生后下丘腦的內(nèi)分泌功能可能有所增強(qiáng)，以氣虛證為甚。但具體到哪種激素?促進(jìn)性或抑制性激素哪個(gè)占優(yōu)勢(shì)，尚待進(jìn)一步分析。

3.3.2 荷瘤小鼠中期陽氣虛證下丘腦表達(dá)上調(diào)的基因 表2顯示，荷瘤小鼠中期陽氣虛證下丘腦表達(dá)上調(diào)且芯片讀數(shù)計(jì)算值大于1000的基因僅1個(gè)。

Dusp8分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，參與抑制促分裂素原活化蛋白激酶和蛋白氨基酸去磷酸化過程。小鼠主要在腦部和肺有表達(dá)。Nesbit等用熒光原位雜交方法發(fā)現(xiàn)，Dusp8雜合子丟失可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[12]。

3.3.3 荷瘤小鼠中晚期氣陰陽虛證下丘腦表達(dá)上調(diào)的基因 表3顯示，荷瘤小鼠中晚期氣陰陽虛證下丘腦表達(dá)上調(diào)且芯片讀數(shù)計(jì)算值大于1000的基因共15個(gè)。

Ptms分布在細(xì)胞核中，與細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、細(xì)胞防御應(yīng)答和發(fā)育有關(guān)，可以通過阻斷胸腺旁腺素α抵制某些機(jī)會(huì)性感染來達(dá)到調(diào)節(jié)免疫功能的目的。

Eif3s5和Eif5a均與蛋白質(zhì)的合成有關(guān)。Eif5a參與真核細(xì)胞翻譯起始過程。研究顯示，Eif5a只參與翻譯后合成多胺源性氨基酸，也與蛋白質(zhì)的合成有一定關(guān)系。Eif3s5則參與蛋白生物合成和調(diào)控翻譯啟動(dòng)[13]。

S100a8分布在胞外區(qū)，與鈣離子結(jié)合參與炎癥應(yīng)答。S100蛋白廣泛存在于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和/或核中，并參與調(diào)節(jié)一些細(xì)胞過程如細(xì)胞周期和分化。正常小鼠以及早期荷瘤小鼠下丘腦S100a8的表達(dá)幾乎關(guān)閉，中期、中晚期表達(dá)突然持續(xù)大幅上升，這與此基因在垂體的表達(dá)趨勢(shì)一致，提示荷瘤小鼠中期和中晚期可能出現(xiàn)一些炎癥反應(yīng)[14]。

Ap1g2和Ap2a1主要分布在細(xì)胞質(zhì)的高爾基堆疊、衣被小凹等，參與蛋白復(fù)合體組裝、細(xì)胞內(nèi)蛋白運(yùn)輸、胞吞等過程，主要參與蛋白合成。

Syt3分布在突觸膜泡和突觸間，參與運(yùn)輸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和鈣離子結(jié)合，在運(yùn)輸和胞吐過程中穿過Ca2+和磷脂結(jié)合的C2域或作為Ca2+的傳感器。

表3 荷瘤小鼠中晚期氣陰陽虛證下丘腦表達(dá)上調(diào)的基因(芯片讀數(shù)計(jì)算值)

Lcn2是脂鈣蛋白的一種，分布在可溶片斷和細(xì)胞質(zhì)中，參與運(yùn)輸脂類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。也有研究發(fā)現(xiàn)，Lcn2可通過與細(xì)菌鐵載體結(jié)合以阻止細(xì)胞生長(zhǎng)來影響細(xì)菌感染的先天免疫應(yīng)答。

Sez6是腦特異性蛋白，可在細(xì)胞間的識(shí)別和神經(jīng)元膜信號(hào)傳遞中發(fā)揮作用，在樹突復(fù)雜結(jié)構(gòu)的信息加工過程中，對(duì)平衡樹突延伸段和分支起到重要的作用，參與正向刺激突觸連接，與癲癇發(fā)作有關(guān)。

Atn1分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，引起的病變?yōu)辇X狀核紅核蒼白球呂伊斯體萎縮(一種罕見的神經(jīng)退行性疾病，包括小腦性共濟(jì)失調(diào)、肌陣攣性癲癇、舞蹈手足徐動(dòng)癥及老年癡呆癥)。

Laptm5是溶酶體蛋白質(zhì)，通過抑制T細(xì)胞表面抗原受體來調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，以控制表面受體的表達(dá)和T細(xì)胞活化。

P140在小鼠主要在腦部、睪丸、肺、腎等組織表達(dá)，在細(xì)胞黏附于纖維蛋白的早期階段延遲細(xì)胞擴(kuò)散，并與嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系的鈣依賴性胞吐作用有關(guān)。

Bat2是關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)錄物，定位于腫瘤壞死因子α和β。此基因包含在人類主要組織相容性復(fù)合物Ⅲ類中，調(diào)節(jié)前體mRNA剪接，是免疫系統(tǒng)的介體。這種基因微衛(wèi)星與胰島素依賴型糖尿病的發(fā)病年齡相關(guān)，并被認(rèn)為可能在胰島素依賴型糖尿病發(fā)展過程中參與了炎癥過程中胰島β細(xì)胞的破壞。

BC033915和LOC620583的功能不清楚。

以上Bat2、S100a8與炎癥的發(fā)生有關(guān)，Laptm5、Ptms、Lcn2 均與免疫抑制有關(guān)，Sez6、Atn1、Syt3、P140與神經(jīng)的發(fā)育以及神經(jīng)間的信號(hào)傳遞有關(guān)，Eif5a、Eif3s5、Ap1g2、Ap2a1 與蛋白質(zhì)的合成和運(yùn)輸有關(guān)。腫瘤發(fā)生后，荷瘤小鼠下丘腦4個(gè)證候的這些基因一致上調(diào)，又以中晚期氣陰陽虛證為甚。其中免疫相關(guān)基因中晚期明顯上調(diào)，可能與荷瘤小鼠在長(zhǎng)期的下丘腦過度活動(dòng)后組織的損傷和修復(fù)有關(guān)，而神經(jīng)發(fā)育及信號(hào)傳遞、蛋白合成及轉(zhuǎn)輸相關(guān)基因的上調(diào)，仍可能提示與神經(jīng)中樞調(diào)節(jié)器官下丘腦功能活躍有關(guān)。

3.4 荷瘤小鼠下丘腦一致下調(diào)的基因

表4顯示，荷瘤小鼠下丘腦一致下調(diào)的基因較少僅 3個(gè)，LOC675606的功能不清楚。小鼠的Hrsp12主要在肝臟和腎臟中表達(dá)，在肺和腦部也有表達(dá)，它是一種核糖核酸內(nèi)切酶，可切斷單鏈mRNA中的磷酸二酯鍵來抑制蛋白的翻譯。

Acta2所編碼的蛋白是高保守蛋白actins的一員，為構(gòu)成細(xì)胞骨架的成分，在真核細(xì)胞中均有這些蛋白的表達(dá)。

表4 荷瘤小鼠下丘腦一致下調(diào)的基因(芯片讀數(shù)計(jì)算值)

腫瘤發(fā)生后，Hrsp12在下丘腦的表達(dá)一致下調(diào)，這與以上一致上調(diào)的基因中含有較多促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯功能是相一致的，進(jìn)一步表明荷瘤小鼠下丘腦細(xì)胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯活躍。同時(shí)結(jié)合上調(diào)基因中含有較多與炎癥功能相關(guān)的基因，Acta2的一致下調(diào)可進(jìn)一步說明，荷瘤小鼠下丘腦內(nèi)細(xì)胞的正常架構(gòu)可能受到了影響。

4 討論

中醫(yī)學(xué)辨證論治注重同病異證、異病同證。辨證結(jié)果顯示，荷瘤小鼠存在典型的同病異證現(xiàn)象，那么出現(xiàn)這種現(xiàn)象的物質(zhì)基礎(chǔ)是什么呢?有研究顯示，中醫(yī)的證候尤其是虛證，其與下丘腦-垂體-內(nèi)分泌軸的功能異常密切相關(guān)，下丘腦正是這些功能軸的中樞部分，在調(diào)節(jié)機(jī)體各項(xiàng)功能方面可能發(fā)揮舉足輕重的作用。本文報(bào)道了荷瘤小鼠不同證候下丘腦一致上調(diào)或下調(diào)的基因，觀察腫瘤小鼠下丘腦基因表達(dá)變化的共性。

值得注意的是，在本輪實(shí)驗(yàn)荷瘤小鼠早期的2個(gè)證候中，氣虛證的基因表達(dá)往往大于邪毒壅盛證，似乎氣虛證下丘腦活動(dòng)更為活躍。為什么會(huì)發(fā)生這樣的改變，其意義如何值得深入研究。

以往限于研究手段，對(duì)下丘腦的研究以形態(tài)學(xué)居多，信息量少，難以充分展現(xiàn)下丘腦病理特征。因而本研究采用先進(jìn)的 Affymetrix“GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array”，該芯片同步觀察16661個(gè)核心基因和大量的外顯子剪接信息，能較好地反映荷瘤小鼠不同證候下丘腦復(fù)雜的基因表達(dá)特征。我們分別把同證候的16只小鼠下丘腦樣本合并檢測(cè)，因而其結(jié)果反映了小鼠下丘腦不同階段基因表達(dá)量的明顯變化。

荷瘤小鼠不同證候下丘腦差異表達(dá)的基因可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，且有證候特征性，一些基因的一致高表達(dá)可能代表了這些證候的本質(zhì)。

通過文獻(xiàn)檢索可以看到，學(xué)術(shù)界以往對(duì)這些基因的研究有較多基因與腦部功能有關(guān)，雖未直接點(diǎn)到下丘腦，但其應(yīng)包括在腦部之內(nèi)。這些基因涉及的功能如神經(jīng)發(fā)育和信息傳遞等均與下丘腦自身功能密切相關(guān)。

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