王喬飛

(江蘇江山制藥有限公司，江蘇靖江 214500)

多維片是綜合營養(yǎng)保健品，其成份極其復(fù)雜，不但包括各種水溶性和脂溶性維生素，還有多種補(bǔ)充的微量元素，其中VD3是一種脂溶性維生素，其含量極低，樣品中僅約含2.5ug/g，且性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光和空氣均易變質(zhì)、降解，而且其它雜質(zhì)對(duì)其穩(wěn)定性和檢測都有影響和干擾，其含量測定一直是個(gè)瓶頸難題。

有關(guān)資料提供的方法，主要采用添加堿液進(jìn)行皂化反應(yīng)，然后采用石油醚、乙醚多次萃取，再用氮?dú)饬鞔蹈商幚?。不但操作過程繁瑣，而且樣品的回收率不穩(wěn)定，操作的重現(xiàn)性很差。有的方法在對(duì)樣品中VD3充分溶出作了考慮，但在處理過程中缺少抗氧、防吸附，減少干擾等措施，致使成分仍有損失而回收率偏低。有文獻(xiàn)報(bào)道，采用反相色譜系統(tǒng)測定，但對(duì)于脂溶性維生素采用反相系統(tǒng)，樣品回收率不滿意。

本文提供了一個(gè)實(shí)用、易操作的檢測方法，無需進(jìn)行皂化處理和反復(fù)萃取等繁瑣操作，而是針對(duì)VD3性質(zhì)不穩(wěn)定，制劑成分復(fù)雜的情況，分別采取了避光、抗氧，抗干擾分離手段，取得了較好效果。特別適用痕量VD3的準(zhǔn)確測定。該方法未見報(bào)道。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200 HPLC系統(tǒng)，配紫外檢測器。

1.2 色譜條件

色譜柱:菲羅門luna 5um silica柱 250*4.6 mm;流動(dòng)相:異丙醇:正己烷(0.5:99.5);流速:2 ml/min;檢測波長:264 nm;進(jìn)樣體積:75 uL。

1.3 試藥

對(duì)照品:VD3:USP standance，Cat no:13100，Lot:MOB157

試劑:正己烷、異丙醇、二甲亞砜為色譜純;氯化鈉、抗壞血酸、吡咯烷二硫代氨基甲酸銨(APDC)為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 各試液的制備

對(duì)照品貯備溶液:精密稱取60.0mg±0.1mg維生素D3對(duì)照品于一250ml棕色容量瓶中，立即用正己烷溶解并稀釋至刻度，此溶液濃度為0.24mg/ml。

對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液:精密吸取上述對(duì)照品貯備溶液用正己烷溶劑再分步稀釋500倍后，得對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液。

樣品溶液制備:取5g APDC和1 g抗壞血酸，溶于1000mL DMSO中，具塞，避光保存，作為萃取溶液;取20片樣品磨細(xì)，精密稱取約5.0g細(xì)粉于一200mL棕色具塞錐形瓶中，加25mL萃取液，上述溶液于超聲水浴機(jī)中60±3℃超聲15min，取出放冷至室溫，加入25.0mL正己烷，強(qiáng)烈振搖，再加15mL18%NaCl溶液，緩緩搖動(dòng)，具塞放冷。高速渦旋混勻約5min，再靜置5min，吸取上層液體于一50mL離心管中，高速離心約5min，取正己烷上清液過濾后注入HPLC液相色譜儀。

2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別制備對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，各取75μL注入液相色譜儀，分別記錄對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液色譜圖(如下圖所示)，結(jié)果VD3和其它雜質(zhì)峰的分離度大于2.0，理論板數(shù)按VD3峰計(jì)算大于2500，表明該系統(tǒng)適應(yīng)性良好。

圖1 對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 樣品溶液色譜圖

2.3 線性關(guān)系

精密稱取維生素D3對(duì)照品，配制濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8μg/mL 的溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，色譜峰面積分別為:9.40，18.64，37.81，57.30，75.77。對(duì)照品峰面積與進(jìn)樣濃度作線性方程:A=97.521C-0.191，C 表示濃度，單位:mg/mL。(n=5，r=0.9999)，樣品溶液濃度范圍為0.1 ～0.8μg/mL。其關(guān)系如圖3。

圖3 工作曲線

2.4 精密度試驗(yàn)

2.4.1 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，分別為:48.2，48.3，48.2，48.0，46.7，47.7，計(jì)算精密度，平均峰面積為 47.85(n=6，RSD=1.26%)。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取本品，照樣品溶液制備方法處理，進(jìn)行含量測定，重復(fù)測定6次，峰面積分別為53.86，53.25，53.66，53.45，54.07，53.59。平均峰面積為 53.59(n=6，RSD=0.62%)。重復(fù)性試驗(yàn)表明，本法的重復(fù)性較好。

2.4.3 中間精密度試驗(yàn)

在不同時(shí)間，由化驗(yàn)室同事照同法操作，用美國Waters 600液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行檢測，記錄色譜圖，計(jì)算VD3平均含量，得VD3平均含量為2.540 ug/g，RSD 為 0.41%。

2.5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取2.4.2 項(xiàng)下樣品溶液，在 0h、1h、2h、4h、6h、8h時(shí)各進(jìn)樣一次，記錄色譜圖，得VD3峰面積的RSD為0.36%，但雜質(zhì)峰的總峰面積在6小時(shí)后有所增加。

2.6 回收率

分別制備含80%，100%，120%維生素D3的樣品，測試回收率。結(jié)果見表1。

表1 樣品回收率結(jié)果

在配方量的80% ～120%范圍內(nèi)，測定平均回收率為99.04%，RSD 為1.11%(n=9)，說明該測定方法準(zhǔn)確度較好。

3 結(jié)論

由于產(chǎn)品中VD3含量很低，能將其充分溶解出來是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵，本法采用萬能溶劑二甲亞砜，并進(jìn)行超聲水浴處理，保證其充分溶出。

針對(duì)VD3遇氧不穩(wěn)定，準(zhǔn)確測量痕量VD3含量，提高其回收率，關(guān)鍵是處理過程中要增加穩(wěn)定手段，同時(shí)，由于組分復(fù)雜，為減少干擾損失，須采取適當(dāng)?shù)姆蛛x方法。為此，本法采取了以下措施方法:(1)加入少量抗壞血酸酸抗氧化降解;(2)加入吡咯烷二硫代氨基甲酸銨(APDC)對(duì)雜質(zhì)離子進(jìn)行絡(luò)合，防干擾;(3)加入氯化鈉溶液，使高分子絮凝，減少吸附損失;(4)采用正已烷對(duì)其充分萃取，起到較好的抗氧化保護(hù)作用。

通過實(shí)驗(yàn)顯示:VD3在低于80℃時(shí)，對(duì)熱穩(wěn)定。故本法可采用60℃水浴加熱。

由于VD3對(duì)光照不穩(wěn)定，因此，在整個(gè)操作過程中均用棕色容器，避光操作。

本法測定復(fù)雜組分中的痕量VD3含量，操作簡便易行，方法重現(xiàn)性好，回收率基本接近100%，結(jié)果準(zhǔn)確。

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